劉 悅，李 丹，張 玉，王 嬋，盛 清，呂正兵，陳 健，張耀洲，聶作明

(1. 浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系，杭州 310018；2. 浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，杭州310018)

microRNA(miRNA)是一類長約22個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA。miRNA可以通過與靶基因mRNA的靶位點(diǎn)結(jié)合，抑制蛋白的合成或誘導(dǎo)該基因mRNA降解，從而參與基因的表達(dá)調(diào)控[1]。miRNA 在各種生物中普遍存在，現(xiàn)已從線蟲、果繩、家鼠、人體、家蠶及擬南芥等生物中分離到了miRNA[2]。查詢專業(yè)的miRNA數(shù)據(jù)庫miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/, Release 20.0)得知，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證的miRNA前體序列達(dá)到24521條，成熟miRNA序列30424條[2]，涉及到206個(gè)物種，主要包括后生動物和被子植物，另外病毒、囊泡藻界和粘菌蟲類生物也有少量發(fā)現(xiàn)。miRNA基因的轉(zhuǎn)錄獨(dú)立于其它基因，并不翻譯成蛋白質(zhì)，而是在體內(nèi)代謝過程中起多種調(diào)控作用，是越來越受關(guān)注的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中重要的調(diào)控因子。

1 miRNA的基因調(diào)控功能

miRNA主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。成熟miRNA結(jié)合到包含Argonaute (AGO)等蛋白的核糖核蛋白復(fù)合物中形成miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(miRNA-induced silencing complex，miRISC)，從而介導(dǎo)特異mRNA靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。miRNA和miRISC復(fù)合體主要通過兩種方式調(diào)控靶基因的表達(dá)，一種是通過堿基非完美互補(bǔ)結(jié)合靶基因mRNA，阻礙翻譯過程，但mRNA水平維持不變；另外一種是完美互補(bǔ)結(jié)合靶基因mRNA，影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性或降解mRNA，從而間接調(diào)控生物的生長發(fā)育[3]。miRNA通過調(diào)控靶基因的表達(dá)行使生物學(xué)功能，已經(jīng)確定的miRNA功能涉及到生物的分子免疫機(jī)制、生長與發(fā)育調(diào)控、干細(xì)胞的分化、細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤發(fā)生以及各種疾病和病毒感染等[4-6]。這些研究表明，miRNA在生物體的生長發(fā)育過程中起到重要的調(diào)控作用。

動物源miRNA主要通過與靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)域(3′UTR)互補(bǔ)匹配導(dǎo)致靶基因mRNA的翻譯受到抑制，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNA靶基因預(yù)測表明，脊椎動物中受miRNA調(diào)控的基因大約至少占所有基因的20%～30%[7-9]，在miRNA靶基因?qū)I(yè)數(shù)據(jù)庫TarBase5.0中(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/)，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的 miRNA靶基因相關(guān)記錄只有1300多條，而在2012年最新版的TarBase 6.0中，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的 miRNA靶基因相關(guān)記錄卻達(dá)到了65814條[10]，已知靶基因數(shù)量的快速增長表明，miRNA靶基因的鑒定成為miRNA功能研究的關(guān)鍵。由于miRNA靶基因的表達(dá)往往很低，同時(shí)鑒定的實(shí)驗(yàn)方法較為煩瑣，實(shí)驗(yàn)操作難度較高，導(dǎo)致至今確定的miRNA靶基因數(shù)量不多。近年來，基于miRNA和靶基因作用原理，出現(xiàn)了很多新的靶基因篩選方法，為miRNA功能研究提供了越來越多的技術(shù)手段[11-13]。植物miRNA主要包括降解組測序法，而動物miRNA靶基因鑒定的方法研究較多，主要包括生物信息學(xué)方法、差異表達(dá)譜方法和近年來出現(xiàn)的miRISC免疫沉淀法。

2 microRNA靶基因的篩選與鑒定的研究方法

2.1 生物信息學(xué)方法

早期的miRNA靶基因鑒定一般從靶基因的預(yù)測開始。動物源miRNA主要通過與靶基因mRNA的3′UTR堿基互補(bǔ)結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，因此動物源miRNA的靶位點(diǎn)主要位于靶基因mRNA的3′UTR，同時(shí)這些區(qū)域往往包含多個(gè)miRNA的多個(gè)靶位點(diǎn)，這些靶位點(diǎn)往往具有物種間保守性，且無明顯二級結(jié)構(gòu)(圖1所示)。根據(jù)以往的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，已知的miRNA與靶基因的結(jié)合方式主要分為3種：1)5′端主導(dǎo)型：miRNA種子序列(miRNA 5′端第2～8個(gè)堿基區(qū)域)和3′端一些連續(xù)的堿基與靶基因完全互補(bǔ)；2)5′端種子主導(dǎo)型：miRNA種子序列和3′端有限的一些堿基和靶基因完全互補(bǔ)；3)3′端互補(bǔ)型：miRNA 序列3′端堿基和靶基因發(fā)生不完全互補(bǔ)配對，同時(shí)有個(gè)別配對向種子區(qū)延伸[14]。根據(jù)miRNA和靶基因的這3類結(jié)合方式以及靶位點(diǎn)的保守性，嚴(yán)格限制預(yù)測條件，我們可以預(yù)測潛在的miRNA靶基因[14]，然后通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些靶基因。但預(yù)測miRNA靶基因首先必須獲得該物種基因的3′UTR數(shù)據(jù)庫，這使得那些基因數(shù)據(jù)庫不全的物種無法通過生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNA靶基因。另外有研究表明，存在少量的miRNA靶基因，其靶位點(diǎn)位于靶基因的編碼區(qū)或5′UTR區(qū)，且主要降解mRNA，同時(shí)有些miRNA和靶位點(diǎn)的結(jié)合并不完全遵守“種子規(guī)則”，而且沒有物種間的保守性[15-17]，這使得生物信息學(xué)無法預(yù)測很多“規(guī)則”以外的靶基因。另外，預(yù)測得到的很多候選靶基因經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并不是真正靶基因[18]，表明利用生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNA靶基因假陽性太多，這為后面的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證帶來很大的困難，因此生物信息學(xué)方法鑒定miRNA靶基因具有一定的局限性。

2.2 差異表達(dá)譜分析法

差異表達(dá)譜分析法分為差異轉(zhuǎn)錄組分析法和差異蛋白組分析法(圖1所示)。差異轉(zhuǎn)錄組分析法先上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞中miRNA，然后通過基因表達(dá)譜芯片分析細(xì)胞中基因的差異表達(dá)，從而獲得候選miRNA靶基因[19, 20]。該方法只能鑒定被miRNA作用導(dǎo)致mRNA降解的靶基因，假陽性較高。蛋白組學(xué)分析法基于miRNA調(diào)控靶基因的蛋白水平，通過氨基酸同位素標(biāo)記培養(yǎng)的方法獲得miRNA介導(dǎo)的蛋白差異水平，從而獲得相應(yīng)的靶基因[21, 22]。該方法也可能存在一定的假陽性，且實(shí)驗(yàn)難度較大。差異表達(dá)譜分析法由于假陽性較高，因此使用較少。

2. 3 miRISC免疫共沉淀法

miRISC免疫沉淀法基于miRNA和靶基因的作用原理(圖1所示)。單鏈miRNA首先結(jié)合核糖核蛋白形成miRISC復(fù)合體，miRISC復(fù)合體通過結(jié)合的miRNA與靶基因mRNA堿基互補(bǔ)，介導(dǎo)該靶基因的切割或者翻譯抑制。miRISC免疫沉淀法使用RISC核糖核蛋白的抗體或表位標(biāo)記物通過免疫沉淀(IP)把RNA-蛋白復(fù)合物一起分離出來，然后對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA(包含miRNA及其靶基因mRNA)進(jìn)行分析[23]。RNA分析方法包括cDNA克隆[24, 25]、基因芯片(IP-Chip)[26, 27]和 近來出現(xiàn)的高通量深度測序(IP-Seq)[28, 29]等。

圖1 miRNA靶基因篩選與鑒定方法

AGO蛋白家族成員是RISC蛋白必需組分。研究表明，和真核起始因子eIF4E一樣，AGO蛋白也能特異性地結(jié)合mRNA 5’端的m7G帽子結(jié)構(gòu)。AGO蛋白結(jié)合miRNA后，在miRNA介導(dǎo)下和靶基因mRNA的m7G帽子結(jié)合，阻止了eIF4E和mRNA帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA翻譯受到抑制[30-32]。因此AGO蛋白能同時(shí)和miRNA及其靶基因mRNA結(jié)合，另外 miRNA和mRNA之間也存在堿基互補(bǔ)結(jié)合，這些結(jié)合力共同作用保證AGO蛋白能形成穩(wěn)定的miRNP復(fù)合體，可以耐受免疫共沉淀的試驗(yàn)條件而不分離。這樣通過直接免疫沉淀AGO蛋白就能把結(jié)合的miRNA和靶基因mRNA一起沉淀下來。為了提高miRISC/miRNP復(fù)合體的穩(wěn)定性，后來又通過紫外交聯(lián)的方法加強(qiáng)了RNA和蛋白的結(jié)合，可直接獲得miRNA和靶mRNA的結(jié)合位點(diǎn)，大大提高了miRISC/miRNP免疫沉淀法的可靠性和靈敏性[28, 29]。

miRISC免疫沉淀法是現(xiàn)今技術(shù)最成熟的方法，其一出現(xiàn)就被廣泛應(yīng)用于miRNA靶基因的規(guī)?；b定[24-29, 33-47]。miRISC免疫沉淀一般采用AGO抗體免疫沉淀天然AGO蛋白，或者先將AGO蛋白和外源標(biāo)簽融合表達(dá)(主要為FLAG、HA和HIS等)，然后用抗標(biāo)簽蛋白的單抗免疫沉淀表達(dá)的標(biāo)簽-AGO融合蛋白。該方法在2007年首先得到利用，Beitzinger等分別使用AGO1和AGO2蛋白的單抗在人類細(xì)胞中進(jìn)行免疫沉淀，得到與AGO1和AGO2蛋白結(jié)合的mRNA各600條，隨機(jī)挑選6條進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測，發(fā)現(xiàn)其中有5條都是miRNA的靶基因[24]。Karginov等在人293s細(xì)胞中分別表達(dá)c-myc-Ago1和c-myc-Ago2融合蛋白，用抗c-myc抗體免疫沉淀，通過基因芯片分析證實(shí)了共沉淀獲得的RISC復(fù)合物中存在miRNA和相應(yīng)靶基因mRNA。進(jìn)一步在293s細(xì)胞中通過載體表達(dá)自身沒有的miR-124a，免疫沉淀miRNP/RISC復(fù)合物中miR-124a靶基因mRNA富集和對照相比高達(dá)7.6～38倍不等。經(jīng)驗(yàn)證從富集的63個(gè)基因中挑選的4個(gè)基因全部都是miRNA的靶基因[27]。Easow等利用HA抗體免疫沉淀果蠅S2細(xì)胞中表達(dá)的HA融合AGO1蛋白，基因芯片分析了miRNP結(jié)合的mRNA后發(fā)現(xiàn)，大量計(jì)算機(jī)預(yù)測的miRNA靶基因得到了富集；為了分析單個(gè)miRNA的靶基因，同時(shí)分析了瞬時(shí)表達(dá)miR-1細(xì)胞中miRNP結(jié)合的mRNA，發(fā)現(xiàn)預(yù)測的miR-1靶基因富集達(dá)到了3倍，進(jìn)一步對野生型果蠅和miR-1缺失果蠅的miRNP結(jié)合mRNA進(jìn)行了分析，得到32個(gè)存在miR-1結(jié)合位點(diǎn)的靶基因，選擇其中11個(gè)結(jié)合位點(diǎn)堿基數(shù)為7(miR-1的2-8位)的靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)全部為miR-1靶基因[26]，為miRNA靶基因的尋找提供了新的思路。 EIF2C2為AGO家族的一個(gè)成員，Landthaler 等在HEK293細(xì)胞中表達(dá)HA-EIF2C2，同時(shí)表達(dá)該細(xì)胞系中沒有的miR-122，抗HA IP使得miRNA和靶基因同時(shí)得到富集，同時(shí)證實(shí)免疫共沉淀miRNP方法不僅能獲得內(nèi)源miRNA靶基因，同時(shí)也能獲得外源表達(dá)的miRNA靶基因mRNA；外源表達(dá)miR-122富集最高的16個(gè)靶基因，有14個(gè)通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，表明可以通過特異性表達(dá)miRNA來獲得該miRNA靶基因[33]。另一個(gè)研究組在HEK239中表達(dá)了FLAG-AGO2，芯片檢測表明，抗FLAG免疫沉淀中的富集mRNA達(dá)1215個(gè)；同時(shí)證明，過表達(dá)AGO對細(xì)胞的內(nèi)源mRNA和miRNA表達(dá)影響很小[34]。

AGO蛋白和靶基因mRNA結(jié)合的牢固程度和miRISC免疫共沉淀結(jié)果好壞直接相關(guān)。Hausser等研究表明，AGO蛋白和mRNA結(jié)合的牢固程度和mRNA三級結(jié)構(gòu)有關(guān)[35]。影響mRNA三級結(jié)構(gòu)因素包括其所處不同的環(huán)境，Hong等研究了不同抗體濃度，孵育時(shí)間和洗脫條件對AGO免疫共沉淀所獲得mRNA的影響，最后優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后提高了共沉淀方法的靈敏度；和未上調(diào)miRNA的對照細(xì)胞相比，上調(diào)miRNA細(xì)胞中AGO IP組分中共有1621個(gè) mRNA的富集具有顯著性差異，其中1191個(gè)基因富集倍數(shù)大于1.4，464個(gè)基因富集倍數(shù)大于2，89個(gè)基因富集倍數(shù)大于4[36]，獲得富集靶基因數(shù)目大大提高。Chi等開發(fā)的HITS-CLIP方法通過紫外照射使AGO蛋白和miRNA與靶基因mRNA產(chǎn)生交聯(lián)，使得RISC復(fù)合體中RNA-蛋白結(jié)合更加穩(wěn)定，形成類似于三聚體的復(fù)合物，結(jié)合高通量測序技術(shù)能獲得全基因組范圍的miRNA靶基因信息[28]。

另外，為了獲得特定miRNA的靶基因，一般在細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)特定miRNA，然后用基因芯片檢測免疫沉淀組分中mRNA富集倍數(shù)的變化來獲得特定miRNA靶基因[24-27, 33-37]。為了進(jìn)一步提高特定miRNA靶基因的鑒定可靠性和靈敏性，Nonne等開發(fā)了TAP-Tar方法，該方法將待研究miRNA進(jìn)行生物素標(biāo)記，然后轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，依次通過GST pull down和生物素pull down獲得AGO復(fù)合物中和目標(biāo)miRNA結(jié)合的潛在靶基因mRNA，通過兩次串聯(lián)篩選，所獲得mRNA為特定miRNA靶基因的可靠性大大提高[38]。Mohammad[25]和Zhao[39]課題組分別采用miRNA種子區(qū)序列為引物，對AGO共沉淀組分中特定miRNA靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得特定miRNA靶基因的可靠性和靈敏度也大大提高。

上述方法雖然能夠得到miRNA靶基因，但不能直接獲得miRNA結(jié)合位點(diǎn)信息，miRNA結(jié)合位點(diǎn)只能通過生物信息學(xué)預(yù)測后通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。IP方法到底傾向于捕獲什么類型的靶位點(diǎn)？Chi等開發(fā)的HITS-CLIP方法通過免疫共沉淀分離紫外照射后的AGO蛋白與結(jié)合RNA復(fù)合物，然后用核酸酶處理，靶基因mRNA的AGO非結(jié)合區(qū)由于沒有AGO蛋白的保護(hù)被切除，通過深度測序獲得剩下的mRNA 與miRNA結(jié)合片段及AGO結(jié)合的miRNA序列，進(jìn)一步采用生物信息學(xué)方法獲得了miRNA全基因組范圍內(nèi)的靶基因結(jié)合圖譜[28]。同樣，Zisoulis等采用CLIP-seq方法[29]，通過紫外交聯(lián)線蟲，用抗ALG-1抗體免疫沉淀獲得穩(wěn)定結(jié)合AGO的miRNA和mRNA，然后同樣用核酸酶處理，剩下mRNA的miRNA結(jié)合片段。該方法從全基因組范圍鑒定了4860個(gè)野生型線蟲所特有miRNA結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)分別位于3093個(gè)基因中，占線蟲已注釋基因的20%。這些miRNA結(jié)合位點(diǎn)序列中種子序列大小在6～8 nt之間，說明IP方法傾向于捕獲結(jié)合位點(diǎn)種子序列在6～8 nt的靶位點(diǎn)。采用相似的方法，Hafner等[40, 41]應(yīng)用PAR-CLIP方法，通過紫外交聯(lián)HEK293細(xì)胞與AGO免疫沉淀，高通量測序獲得將近20000個(gè)富集的序列片段，90%片段能夠和高表達(dá)miRNA的種子序列匹配。上述方法只能分別獲得AGO結(jié)合miRNA和靶基因結(jié)合位點(diǎn)序列，然后需借助生物信息學(xué)方法匹配miRNA及其相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，可能出現(xiàn)一定的錯(cuò)誤，不能直接獲得miRNA及其相應(yīng)靶基因結(jié)合位點(diǎn)序列。Helwak等采用CLASH方法將紫外交聯(lián)后的RISC復(fù)合物用核酸酶酶切，酶切產(chǎn)物中受AGO蛋白保護(hù)的miRNA及其靶基因結(jié)合片段用RNA連接酶連接后直接通過高通量測序，獲得miRNA及其相應(yīng)靶基因結(jié)合位點(diǎn)序列。該方法共獲得18514個(gè)miRNA-mRNA結(jié)合對，代表399個(gè)miRNA及其對應(yīng)的6959個(gè)靶基因[46]。上述結(jié)果表明，結(jié)合紫外交聯(lián)與高通量測序技術(shù)，我們可以在基因組范圍內(nèi)鑒定miRNA靶基因的結(jié)合位點(diǎn)，大大提高了解析miRNA靶基因的能力[47]。

3 小結(jié)

miRNA靶基因的高通量鑒定與篩選對miRNA的功能解析起至關(guān)重要的作用。由于miRNA和靶基因的作用位點(diǎn)并不完全匹配，沒有明顯的規(guī)律可尋，導(dǎo)致應(yīng)用傳統(tǒng)方法鑒定與篩選靶基因十分困難。因此，開發(fā)高通量特異的，靈敏度高的miRNA靶基因篩選與鑒定方法對miRNA功能研究變得十分重要。

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