盛 樟，竺俊全

(寧波大學 海洋學院，浙江 寧波 315211)

金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)是細胞內一類低分子量(6～7 kDa)、富含半胱氨酸(Cys)的蛋白超家族，最早發(fā)現(xiàn)于馬腎皮質中[1]，迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)MT廣泛存在于動物、植物和一些微生物體內。近年來，伴隨工業(yè)化進程的不斷推進，大量排放的工業(yè)廢水使各水域遭受不同程度的重金屬污染，重金屬在水生生物體內的富集超過機體自身所能承載的負荷，從而對它們的生長、繁育、生理代謝等造成毒性危害，同時可能引起遺傳物質變異，使機體免疫力、存活力下降，物種多樣性喪失[2]。MT能夠調節(jié)機體必需重金屬的穩(wěn)態(tài)及對有害重金屬進行解毒，并起氧化應激防護作用，因而可作為指示水環(huán)境重金屬污染的一種生物學指標。水生動物MT分子毒理學是指對水生動物體內MT結構與性質及其在重金屬脅迫下的組織表達與功能進行研究。本文就該領域的研究進展進行綜述。

1 金屬硫蛋白概述

1.1 金屬硫蛋白的結構

Cho等[3]研究一種鯉科淡水魚HemibarbusmylodonMT基因組結構后發(fā)現(xiàn)，外顯子/內含子以GT/AG拼接規(guī)則形成一種三重結構，而在斑馬魚(Daniorerio)[4]及蟹類[5]體內也發(fā)現(xiàn)由3個外顯子與2個內含子組成的MT基因存在這種保守的拼接信號。水生脊椎動物MT基因5′側翼調控區(qū)普遍存在轉錄因子結合位點，能夠結合AP-1、Sp1及HNF-5等轉錄因子[6]，而且5′側翼調控區(qū)中的保守基序如重金屬應答元件(MREs)是金屬應答轉錄因子MTF-1的靶向位點，當機體遭遇重金屬脅迫等損傷時，二者結合以調控基因的表達，從而使細胞作出應激應答[4]。Ren等[7]對中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)MT基因組結構分析后發(fā)現(xiàn)基因5′側翼調控區(qū)也存在多個轉錄因子結合位點及MREs，在該基因表達調控方面發(fā)揮不同程度的作用。水生動物MT基因3′非編碼區(qū)(3′-UTR)存在保守的多聚腺苷酸信號(ATTAAA或AATAAA)[4,5,7,8]，而在蟹類體內還發(fā)現(xiàn)3′-UTR分布有“CACC”基序[5,8,9]，這些基序可能對MT mRNA的定位至關重要。

MT主要分布于細胞質內，構成一類小分子蛋白超家族，不含芳香族氨基酸，一般具有高度保守的18～23個Cys，Cys上的巰基可結合特異的重金屬離子。MT一級結構最顯著的特征是含有Cys-Cys、Cys-X-Cys、Cys-X-X-Cys、Cys-X-X-X-Cys基序(X表示除Cys外的其它氨基酸)[7-9]，這些基序對重金屬離子如銅、鋅、鎘、汞等表現(xiàn)出強親和力[10]。Mao等[8]研究日本蟳(Charybdisjaponica)MT二級結構發(fā)現(xiàn)存在一段保守的螺旋區(qū)。哺乳類MT的三維結構分為C末端的α結構域與N末端的β結構域，分別可結合4個重金屬離子與3個重金屬離子；在無脊椎動物如蟹類體內，MT的兩個結構域分別可結合3個重金屬離子[10]。

1.2 金屬硫蛋白的功能

MT的結構特征決定其能與重金屬離子結合，可作為必需重金屬的儲存庫，參與鋅、銅等必需金屬元素的穩(wěn)態(tài)調節(jié)過程，以滿足機體新陳代謝的需求。有害重金屬(如鎘、汞等)進入細胞后，會與胞內必需重金屬競爭配體，此時，MT的巰基能與有害重金屬強烈螯合，發(fā)揮解毒作用，及時將有害物質排出體外。Amiard等[11]研究結果顯示，鎘脅迫后MT表達量受誘導而升高，進而清除羥基和過氧化物，使機體抵御氧化應激反應。

1.3 金屬硫蛋白的分類與分布

綜合分子量、重金屬結合位點、基因序列、染色體結構等多種因素，可將MT劃分為4種異構體，即MT-Ⅰ，MT-Ⅱ，MT-Ⅲ和MT-Ⅳ。其中，前兩者在大多數(shù)動物的內臟器官中均有分布，尤以肝臟、腎臟為主；后兩者一般存在于特化細胞中，如MT-Ⅲ主要分布于哺乳類中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質細胞與神經(jīng)元中，MT-Ⅳ發(fā)現(xiàn)于復層上皮細胞中[12]。

圖1斑馬魚MT氨基酸序列與其它物種比對[4]

Fig 1 Alignment of zebrafish MT amino acid sequence with other species[4]

2 水生動物金屬硫蛋白分子毒理學

2.1 魚類金屬硫蛋白分子毒理學

國際上對模式生物斑馬魚MT分子毒理學的研究日益增多。Chen等[4]揭示了斑馬魚MT序列與其它物種具有高度的同源性(見圖1)。Riggio等[13]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚卵母細胞發(fā)育過程中銅和鋅含量變化與MT表達量變化呈正相關，而胚胎發(fā)育過程中銅和鋅含量變化與MT表達量變化無明顯相關性；當斑馬魚胚胎暴露于鎘時MT含量在囊胚期被誘導升高，而在原腸期無此現(xiàn)象；使用DNA甲基轉移酶抑制劑預處理斑馬魚原腸胚，觀察到鎘誘導了MT的合成，據(jù)此推測DNA甲基化可能是調控基因表達的一個因素。Yan等[14]對斑馬魚MT基因結構進行研究后提出，啟動子區(qū)包含4個MREs，其中距離轉錄起始位點740 bp處的1個MRE對重金屬誘導MT基因表達具有重要作用，而靠近TATA框的3個MRE對MT基因的誘導表達沒有顯著作用。Chan等[15]經(jīng)探究發(fā)現(xiàn)，當斑馬魚的胚胎-幼體用于體內試驗時，汞離子是對MT mRNA最有效的誘導物，而對斑馬魚肝臟細胞系進行體外試驗時，鎘離子是最有效的誘導物。Cheuk等[16]使用斑馬魚的肝臟細胞系和尾鰭細胞系，研究了多種重金屬離子對MT和MTF-1 mRNA水平的誘導情況，結果表明，鎘離子是兩個細胞系中MT的最有效的誘導物，在尾鰭細胞系中亦對MTF-1 mRNA的水平有明顯的劑量依賴性誘導。

Cho等[17]從細鱗泥鰍(Misgurnusmizolepis)體內獲得MT-I的2種亞型——MT-IA與MT-IB。對于這2種亞型，研究者測定得到一個頭尾串聯(lián)的基因組組織方式，鑒定了基因組的保守性特征，顯示二者編碼區(qū)序列具有高度的同源性，且通過檢測發(fā)現(xiàn)，近親祖先的一個基因復制事件導致了二者的分離。然而，這2種亞型的5′ 側翼上游區(qū)在多種轉錄因子結合基序的組織排列方式上存在著很大差異。用鎘、鉻、銅、鐵、錳、鎳和鋅分別處理細鱗泥鰍48 h，MT-IA和MT-IB的轉錄調控方式存在明顯不同，且應答類型因金屬和組織種類而異。

將一組濃度梯度的鎘離子依次與濃度固定的鋅離子聯(lián)合脅迫鯽魚(Carassiusauratus)，肝臟和腎臟中MT表達量的總體變化趨勢較一致，均呈現(xiàn)先升高后降低再升高。在0～12 h內鯽魚肝臟和腎臟中MT增加量與鎘含量呈正相關，表明聯(lián)合脅迫可誘導鯽魚組織中MT的表達[18]。

Vergani等[10]對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)體內重組體MT-A進行了克隆、純化與鑒定，并研究了鎘脅迫下該重組體結合金屬的能力，結果表明，隨著MT-A與鎘結合，在254 nm處出現(xiàn)吸收峰，且當鎘與MT-A形成復合體結構后，會誘導蛋白質折疊。

用鎘對河豚(Takifuguobscurus)進行處理，相比腦、鰓絲和腎臟，肝臟中MT表達量最高，肌肉中MT表達很弱。早期(6 h時)腦中MT表達量最高，隨后腸中MT被持續(xù)誘導表達。在所有組織中，MT mRNA表達均呈現(xiàn)重金屬濃度依賴性。然而，與其它組織相比，腦和肝臟中僅很低的鎘濃度即可誘導MT mRNA表達，表明這兩種組織中MT能夠發(fā)揮高效的解毒作用[19]。

Isani等[20]對金頭鯛(Sparusaurata)體內鎘含量及其生化應答情況進行分析后發(fā)現(xiàn)，未受鎘脅迫時，鰓絲中鎘含量顯著高于肝臟，而當機體暴露于0.1 mg/L鎘后，鎘在肝臟中隨脅迫時間延長而快速累積，在血漿、肌肉和腎臟中也能檢測到鎘。鎘脅迫4 d后，肝臟與腎臟中MT表達量無顯著變化，但11 d后鎘-MT復合體含量明顯升高。MT表達量達到峰值時，鋅與銅的濃度也相應較高。以上結果表明，魚類的鰓絲是直接暴露于水體的器官，重金屬離子首先進入鰓絲，經(jīng)血液循環(huán)分布于各器官，最后主要累積于代謝場所——肝臟與腎臟。鎘脅迫時間延長后MT與鎘結合形成復合體以達到解毒的作用，并相應提高了必需重金屬鋅和銅的含量，以調節(jié)金屬在機體內的動態(tài)平衡。另外，紅細胞彗星試驗結果顯示低濃度(0.1 mg/L)鎘脅迫11 d不足以引起金頭鯛DNA損傷，而鎘對其組織細胞學結構造成的損傷尚待進一步研究。

2.2 甲殼類金屬硫蛋白分子毒理學

Ren等[7]對中華絨螯蟹的MT-ⅠcDNA和基因組序列進行了克隆與分析，并對MT-Ⅰ基因在肝胰腺中的銅誘導表達及在精巢中的季節(jié)性表達情況進行了研究。結果表明，肝胰腺中MT-Ⅰ基因表達量在0.1 mg/L銅脅迫7 d時達到峰值，后隨時間延長而逐漸下降，由此可知MT基因表達水平不會在組織中無限制升高，在重金屬脅迫早期，其表達量會逐漸上升，然而，隨著毒性的不斷積累，超過一定程度后，MT應答效應會趨于減弱，造成機體新陳代謝紊亂，某些蛋白質的合成受阻，其中也包含MT合成量減少；精巢中MT-Ⅰ基因表達量在8月最高，在9月急劇下降，至11月進入季節(jié)性低谷，說明MT-Ⅰ基因的表達與該物種的生殖季節(jié)有著內在的關聯(lián)，可能在生殖與發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

長江華溪蟹(Sinopotamonyangtsekiense)經(jīng)鎘處理后，心臟、鰓絲和肝胰腺等組織中鎘的積累量隨處理時間的延長而增加；MT基因表達量隨水體中鎘濃度的升高而呈現(xiàn)上升勢態(tài)，但其與同一鎘濃度處理過程中鎘的積累量無關，其中，肝胰腺中MT基因表達量受鎘誘導的倍數(shù)最高[21]。Ma等[22]在河南華溪蟹(Sinopotamonhenanense)體內發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，肝胰腺中MT基因表達量高于鰓絲、肌肉和卵巢。由此可見，作為蟹類體內主要的解毒器官，肝胰腺中MT對重金屬脅迫的應答效應最強。

眼斑龍蝦(Panulirusargus)體內MT基因在肝胰腺、腸、神經(jīng)組織和肌肉中廣泛表達，在肝胰腺中表達量最高，在肌肉和神經(jīng)組織中最低。此外，重金屬對MT表達的調控呈現(xiàn)出差異性：鎘能誘導除肌肉外的所有組織中MT mRNA水平升高，對神經(jīng)組織的誘導效應最為明顯；鋅僅在肝胰腺中發(fā)揮誘導作用；銅對所有組織的MT mRNA均無誘導效應[23]。以上結果表明肝胰腺中MT對鎘解毒與鋅穩(wěn)態(tài)調節(jié)具有重要作用；神經(jīng)組織中MT能夠保護這種具有高度敏感性的組織免受鎘引發(fā)的神經(jīng)毒性。

由于近年來MT分子毒理學研究主要集中于MT在機體內主要解毒器官(如肝臟、腎臟)及與水體直接接觸器官(如鰓絲)中的表達與功能分析，有關其對水生動物尤其是水生無脊椎動物生殖與發(fā)育的影響等方面的研究較少。Mao等[8]對日本蟳MT基因序列及蛋白結構進行了分析，并檢測了精子形成期MT mRNA的時空表達模式。研究表明，日本蟳MT在C末端上多出非保守性Cys，可能有利于抵御重金屬污染。在早期精細胞中，MT mRNA主要聚集于細胞核的一端；中期精細胞中，MT mRNA主要集中于原頂體中，有一些存在于膜復合體中；后期精細胞及成熟精子中，MT mRNA分布于頂體管和膜復合體中。Xiang等[9]對三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)精巢中MT-Ⅰ及MT-ⅡmRNA進行定位分析后獲得的結果與以上基本一致。由于鎘離子與鈣離子結構相似，易取代鈣離子參與一些相關生理反應，根據(jù)以上結果推測頂體管中MT的作用可能是保護頂體及與鈣離子通道有關的頂體反應，免受鎘脅迫引發(fā)的損傷。

2.3 軟體動物金屬硫蛋白分子毒理學

Wang等[24]發(fā)現(xiàn)在一種淡水雙殼貝Pyganodongrandis中，由于其鰓絲直接暴露于水體中，與重金屬直接接觸，是水環(huán)境中有害物質的主要吸收器官，在一組濃度梯度鎘離子的脅迫下，鰓絲中MT表達量與鎘濃度呈現(xiàn)正相關關系。

太平洋牡蠣(Crassostreagigas)的MT基因編碼區(qū)序列上存在低水平的多態(tài)現(xiàn)象，其MT-Ⅰ和MT-Ⅱ兩種異構體可能參與解毒反應[25]。這種牡蠣生活在一個廣泛的潮高范圍內，常會遭遇較大的溫度波動。對MT和熱休克蛋白(HSP)這兩種應激蛋白的基因表達水平進行定量分析，結果顯示生活在低潮高處和高潮高處的牡蠣其鰓絲、套膜和消化腺中這兩種蛋白的含量相近。相反，性腺中內生的HSP和MT的含量在配子發(fā)生過程中有顯著變化。在雌性個體的性腺中，HSP70和MT的組成型水平從未成熟(或靜止)階段增加至成熟階段，在產(chǎn)卵后下降。在雄性個體的性腺中也觀察到了相同的變化情況，而在性完全成熟后蛋白含量下降。在產(chǎn)卵期雌性個體HSP和MT的表達量比雄性個體更高。因此，Meistertzheim等提出了卵細胞中高水平的應激蛋白可能提高牡蠣后代存活力這一假說[26]。

3 總結與展望

重金屬是生物機體內生理生化過程中不可缺少的因素。然而，在天然因素與人為因素的共同作用下，大量重金屬流入各海域與江河中，超越了水生生態(tài)系統(tǒng)的承受能力，使水生生物的生存與繁殖面臨嚴重的威脅。水生動物是水環(huán)境中極其重要的組成部分，重金屬污染會降低水生動物的生殖與適應能力，引發(fā)動物體內各項生理生化機能損傷，造成新陳代謝紊亂，甚至在分子水平上對機體產(chǎn)生致命效應。本文簡要綜述了多種水生動物MT分子毒理學研究進展，分析了MT基因序列及蛋白結構的明顯特征，揭示了MT在水生動物體內具有維持必需重金屬穩(wěn)態(tài)、對有害重金屬解毒、抵御氧化、維持機體正常的生長發(fā)育及生理代謝等作用，可作為監(jiān)測水環(huán)境重金屬污染的生物學指標。關于MT的研究已逾50年，對其結構、功能與表達等方面已有一定了解。國內外對水生動物MT分子毒理學研究已廣泛開展，目前主要集中于研究MT在環(huán)境監(jiān)測方面的應用，但有關MT基因序列上游側翼調控區(qū)多種應答元件的作用機制及MT對水生動物發(fā)育的影響等方面少有涉及，有待深入探討以豐富MT研究資料。

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