楊文蘭，韓春春，王繼文，劉丹丹，萬(wàn)火福, 劉賀賀，潘志雄

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物遺傳育種研究所，成都 611130)

胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素，是一種重要的體內(nèi)調(diào)節(jié)因子[1]。胰島素能夠刺激許多類(lèi)型的細(xì)胞和組織內(nèi)蛋白質(zhì)的合成[2]，同時(shí)在體外胰島素對(duì)細(xì)胞增殖與分化具有促進(jìn)作用[3]，但其對(duì)不同細(xì)胞體系的增殖作用有所不同[4]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)一些細(xì)胞體系特別是成纖維細(xì)胞, 胰島素需在超出其生理濃度的高濃度下才有顯著的促增殖作用。低濃度胰島素(100 ng/mL)能誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖，生理濃度胰島素(50 ng/mL)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖2～4倍[5]。有報(bào)道認(rèn)為胰島素具有促進(jìn)肝再生的作用[6]，能夠刺激小鼠肝細(xì)胞增殖[7]。在生產(chǎn)上通過(guò)對(duì)水禽進(jìn)行填飼碳水化合物生產(chǎn)肥肝，導(dǎo)致肝臟和身體其它部位生長(zhǎng)速度急劇增加，因此推測(cè)水禽具有很強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力和蛋白合成功能。填飼誘導(dǎo)肥肝的生成伴隨著血漿胰島素濃度的升高[8]，我們推測(cè)胰島素對(duì)肝細(xì)胞增殖和蛋白合成具有促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將不同濃度的胰島素作用于鵝原代肝細(xì)胞，檢測(cè)胰島素對(duì)細(xì)胞增殖和蛋白合成的影響，為研究水禽肥肝生成機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 鵝原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

采用半原位Seglen二步膠原酶灌注法分離3只天府肉鵝(Ansercygnoides)的肝細(xì)胞。全培養(yǎng)基包括EMDM低糖培養(yǎng)基和胎牛血清，將肝細(xì)胞接種到35 mm培養(yǎng)皿和6孔培養(yǎng)板中，靜置在40 ℃、5% CO2氣相和飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 h后用PBS清洗3次后更換為10%血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后換無(wú)血清培養(yǎng)基，再繼續(xù)24 h后更換為加0 nmol/L、5 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L及200 nmol/L不同濃度胰島素處理的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后取樣，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2 細(xì)胞上清液谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GPT)濃度測(cè)定

鵝肝細(xì)胞經(jīng)不同濃度的胰島素處理48 h后用2 mL EP管收集細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL，用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)細(xì)胞上清液中ALT、AST濃度。

1.3 細(xì)胞上清液總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)濃度的測(cè)定

鵝肝細(xì)胞經(jīng)不同濃度的胰島素處理48 h后用2 mL EP管收集細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL，用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)細(xì)胞上清液中TP、ALB濃度。

1.4 Brdu-ELISA法檢測(cè)DNA含量

96孔板中鵝肝細(xì)胞加入葡萄糖處理24 h后每孔加入BrdU 10 μL標(biāo)記細(xì)胞。棄液后加入固定液室溫固定30 min使DNA變性，洗滌3次后加入BrdU一抗，洗滌后加入山羊抗小鼠IgG過(guò)氧化物酶共軛結(jié)合物，洗滌，添加TMB過(guò)氧化物酶作用底物，加入終止反應(yīng)液終止反應(yīng)，將96孔板放酶標(biāo)儀上用450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度(OD值)。OD值越高表示樣品中DNA含量越高。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS ll.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間指標(biāo)的比較均采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，LSD—t和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰島素對(duì)肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AST和ALT濃度的影響

圖1表明，與對(duì)照組相比，50 nmol/L、100 nmol/L和150 nmol/L胰島素對(duì)鵝肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AST濃度影響不顯著(P>0.05)，200 nmol/L胰島素明顯增加了鵝肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT濃度，而幾個(gè)濃度的胰島素對(duì)培養(yǎng)上清液中AST濃度沒(méi)有明顯影響(P<0.05)。

2.2 胰島素對(duì)鵝肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TP和ALB濃度的影響

圖2表明，與對(duì)照組相比，50 nml/L胰島素對(duì)鵝肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TP和ALB濃度沒(méi)有明顯影響(P>0.05)，100 nml/L、150 nml/L和200 nml/L胰島素顯著增加細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TP和ALB的濃度(P<0.05)。

圖1 不同濃度胰島素對(duì)鵝肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液ALT和AST濃度的影響

圖2 不同濃度胰島素對(duì)鵝肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液TP和ALB濃度的影響

2.3 不同濃度胰島素對(duì)鵝原代肝細(xì)胞DNA合成的影響

圖3 不同濃度胰島素對(duì)鵝肝細(xì)胞DNA合成的影響

Brdu-ELISA法檢測(cè)DNA含量結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，隨著胰島素濃度增加鵝原代肝細(xì)胞內(nèi)DNA合成的量增加。50 nmol/L、100 nmol/L和150 nmol/L 3個(gè)胰島素處理組的鵝原代肝細(xì)胞DNA合成量差異顯著(P<0.05)。

3 討論

ALT主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，只要有1%的肝細(xì)胞壞死，就可以使血清酶增高1倍。AST主要存在于肝細(xì)胞的線粒體內(nèi)，只有當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重壞死或破壞時(shí)，才能引起谷草轉(zhuǎn)氨酶的血清濃度偏高。ALT和AST的正常參考值為0～40 U/L。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液ALT和AST的濃度反映胰島素對(duì)肝細(xì)胞損害情況的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度胰島素處理后的鵝原代肝細(xì)胞ALT和AST含量差異不明顯(P<0.05)，且都在正常范圍內(nèi)，說(shuō)明0～200 nmol/L胰島素沒(méi)有損害鵝肝細(xì)胞的功能。

越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證明在體外胰島素對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。胰島素可明顯促進(jìn)小鼠血管平滑肌細(xì)胞[9]、心肌細(xì)胞[10]、成纖維細(xì)胞[11]、人白血病細(xì)胞[12]、腫瘤細(xì)胞[5]及骨髓瘤細(xì)胞[13]的增殖作用。Wahner Hendrickson等用不同濃度胰島素(1.7～1722 nm/mL)作用于HL-60、U937、ML-1 細(xì)胞48 h后，結(jié)果顯示1.7 nmol/L的胰島素可促進(jìn)細(xì)胞增殖，隨著濃度增高，促增殖作用增強(qiáng)，各細(xì)胞系的最佳促進(jìn)濃度不一，進(jìn)一步加大濃度，促增殖作用逐漸減弱[4]。本實(shí)驗(yàn)BrdU-ELISA法結(jié)果表明在胰島素濃度為0～200 nmol/L時(shí)，隨胰島素濃度的增加，細(xì)胞增殖率增加，說(shuō)明0～200 nmol/L胰島素可以促進(jìn)鵝原代肝細(xì)胞增殖。

胰島素能刺激胚胎細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞及骨骼肌的蛋白合成功能[ 4,14,15]。研究表明胰島素可以明顯促進(jìn)小鼠血管平滑肌細(xì)胞膠原蛋白的合成[9]，10-7nmol/L胰島素對(duì)小鼠心肌細(xì)胞蛋白合成的促進(jìn)作用最為明顯[11]。另外，研究表明胰島素通過(guò)激活mRNA翻譯快速促進(jìn)肌肉蛋白合成[16，17]，飼喂小鼠引起的胰島素分泌的增加如果被藥物抑制，導(dǎo)致蛋白翻譯啟動(dòng)阻止和蛋白合成抑制[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示50 nmol/L胰島素對(duì)鵝原代肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中總蛋白和白蛋白濃度沒(méi)有明顯影響，而100 nmol/L、150 nmol/L和200 nmol/L胰島素顯著增加鵝原代肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中總蛋白和白蛋白的濃度，表明胰島素能夠激活鵝原代肝細(xì)胞的蛋白合成功能，而具體的調(diào)控機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

總之，0～200 nmol/L胰島素對(duì)鵝原代肝細(xì)胞中蛋白合成和細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，高濃度時(shí)促進(jìn)效果更為明顯。

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