陳 強，陸新江，黃左安，陳 炯

(寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實驗室, 浙江 寧波 315211)

洄游型魚類(Amphidromous type fishes)在其生長的不同時期更換生活水域，常見的魚類洄游包括索餌洄游、越冬洄游和生殖洄游；而陸封型魚類(Land-locked type fishes)是由于洄游魚類無法在繁殖季節(jié)返回到大海中，生活在湖泊中形成的。陸封型和洄游型常常同時存在于一個魚類物種中，比較典型的有大西洋鮭(Salmosalar)[1]、胡瓜魚(Hypomesusnipponensis)[2]以及香魚(Plecoglossusaltivelis)[3]。有文獻報道表明，洄游型和陸封型在生殖、代謝以及遺傳多樣性等多方面可能存在著差異，比如Drevecky等人利用微衛(wèi)星位點和線粒體測序技術研究同一地區(qū)陸封型和洄游型三刺魚(Gasterosteusaculeatus)遺傳多樣性的差異，提出它們之間存在生殖隔離的理論基礎[4]；Morinville等人研究了陸封型和洄游型美洲紅點鮭(Salvelinusfontinalis)之間食性和代謝水平的差異，指出其代謝效率和洄游行為之間存在聯(lián)系[5]。魚的體腎可以調(diào)節(jié)滲透壓，維持魚類體內(nèi)的平衡和穩(wěn)態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)，體腎在魚類滲透壓調(diào)控，特別是魚類在淡水和海水之間適應的過程中發(fā)揮作用[6]，因此陸封型和洄游型魚類的體腎蛋白表達可能存在許多差異。

香魚隸屬于胡瓜目，具有散發(fā)清香、味道鮮美等優(yōu)點。典型的洄游型香魚的幼魚在入?？诜趸蠡氐胶Ｖ羞^冬，到了春天，它們洄游回到溪流中生長，秋天在入?？诋a(chǎn)卵并且死去；而陸封型香魚則生活在固定的水域，不發(fā)生洄游現(xiàn)象。所以，洄游型香魚幼年期間有過海水生活的經(jīng)歷，而成年以后洄游型香魚和陸封型香魚的生存環(huán)境幾乎相同。香魚是一種研究洄游型和陸封型魚類之間差異的良好模型，目前已知陸封型和洄游型香魚在體型大小、幼魚存活率等諸多方面存在差異，特別是陸封型香魚的體型明顯比洄游型香魚小[7，8]。滲透壓調(diào)控因消耗大量能量從而影響魚類生長，體腎組織可介導滲透壓調(diào)控從而影響魚類生長[9]。我們由此假設，陸封型和洄游型香魚體腎組織蛋白組表達差異可能解釋陸封型香魚體型偏小。

蛋白組學相關技術以其高效、功能強大等優(yōu)點而在魚類的非模式生物蛋白組相關的研究中發(fā)揮重要作用[10]。本次研究對洄游型和陸封型香魚體腎組織蛋白組的差異進行研究，并對差異蛋白點進行鑒定。利用雙向電泳和質(zhì)譜技術，再參考NCBI非冗余(NCBInr)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，我們鑒定了21個差異明顯的蛋白點。隨后利用采用熒光定量PCR(RT-PCR)技術對熱適應相關蛋白65(Wap65)、熱休克蛋白60(HSP60)和丙酮酸脫氫酶(E1)這3種基因mRNA含量差異進行研究，驗證了雙向電泳的結果。我們的實驗結果為進一步從分子生化水平上分析陸封型和洄游型香魚之間的差異奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與試劑

健康的陸封型香魚15條，采集自福建東張水庫，洄游型香魚13條，采集自浙江楠溪江。RNAiso試劑、Oligotex-dT30mRNA Purification Kit、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、cDNA Library Construction Kit 和SYBR PremixExTaq試劑盒均購于Takara公司；ReadyStrip IPG膠條、PROTEAN IEF Cell等電聚焦電泳儀和PROTEANII Xi垂直電泳儀購于Bio-Rad公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS/MS)購于Mass Spectra公司；Applied Biosystem Real-time PCR儀器購于Applied Biosystem公司。

1.2 雙向電泳樣品制備

購買來的陸封型和洄游型香魚在實驗條件下暫養(yǎng)2周，PBS清洗后快速取其體腎組織，投入液氮中保存。陸封型和洄游型香魚分別進行3次蛋白質(zhì)組學實驗，每個樣本來自于4條魚的體腎組織混合樣。

根據(jù)稍作改動的SWISS-2D PAGE樣品準備方案，通過將陸封型和洄游型香魚的蛋白提取物進行等量混合來制備樣品。取出液氮中保存的體腎組織，進行初步分離后和含有7 M尿素、2 M硫脲、4% CHAPS(W/V)、65 mM DTT以及0.2%(W/V)兩性電解質(zhì)的溶液混合。蛋白質(zhì)樣品用丙酮進一步提取和濃縮后，達到80%(V/V)的濃度。蛋白樣品的濃度通過Bradford定量法進行測定。

1.3 雙向電泳及結果分析

取1 mg蛋白樣品上樣，使用ReadyStrip IPG膠條進行雙向電泳。先采用非線性pH梯度的膠條在PROTEAN IEF Cell等電聚焦電泳儀中進行等點聚焦電泳，電泳條件為50 V進行12 h，250 V進行1 h，500 V進行1 h，1000 V進行1 h，最后用8000 V進行11 h。等電聚焦電泳結束后，將IFG膠條轉(zhuǎn)移到12%的SDS-PAGE膠上，采用PROTEANII Xi垂直電泳儀進行SDS-PAGE電泳，50 mA條件下進行5 h，陽極和陰極電泳緩沖液分別為含有15%甲醇的Tris-CAPS緩沖液和含有0.1% SDS的Tris-CAPS緩沖液。SDS-PAGE電泳結束后，采用考馬斯亮藍G-250染色液進行染色。同樣的方法對每個樣品進行3個重復。染色結束后，采用PDQuest 2-D軟件對結果進行分析。

1.4 質(zhì)譜分析

根據(jù)分析結果，挑選了樣品組之間有顯著差異而樣品重復之間無顯著差異的蛋白點，將其所在位置的膠進行切割和研磨后用純水清洗，切下來的蛋白采用含有100 mM的NH4HCO3溶液(含有10 mM的DTT)進行還原。然后采用50 mM的NH4HCO3溶液對蛋白進行清洗，干燥后用消化液進行消化，消化液為50 mM的NH4HCO3溶液 (含有12.5 ng/μL胰蛋白酶)。1 h后，上清消化液換用50 mM的NH4CO3溶液，并且37℃孵育過夜。

蛋白樣品用5 μL的基質(zhì)溶液溶解后進行超聲2 min。取1 μL超聲后的產(chǎn)物，用MALDI-TOF-MS/MS以及4700 Proteomics Analyzer軟件進行分析。得到的數(shù)據(jù)用Mascot search V2.1軟件在NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行查找，查找設置參數(shù)為：error=100 ppm; index mode=combined (MS+MS/MS); searching database parameter=trypsin; max missed cleavage=one; variable modifications=acetyl (N-term), carbamidomethyl (C), and oxidation (M); MS/MS Fragment Toleration= 0.2 Da; precursor tolerance=0.2 Da; peptide charge=+1; maximun peptide rank=10; minimum ion score C.I.%=0。

表1 香魚Wap65、HSP60和E1基因cDNA擴增的引物設計

1.5 mRNA表達分析

采用RNAiso試劑分別提取陸封型和洄游型香魚腎組織的總RNA，用DNase I (RNase-free)處理后，以1 μg總RNA為模板，oligo(dT)30為引物，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。設計選定基因的特異性擴增引物(表1)，采用Applied Biosystem Real-time PCR儀，以陸封型和洄游型香魚體腎組織的cDNA為模板來分析所選基因的mRNA含量的差異，RT-PCR的方法同文獻[11]。為確保準確性，每個RT-PCR反應重復3次，包括目的基因和18S rRNA。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS軟件，采用單因素方差分析方法(one-way ANOVA)對RT-PCR的結果進行統(tǒng)計分析，以P<0.05作為顯著差異。

2 結果與分析

2.1 雙向電泳及蛋白點鑒定

A—洄游型香魚；B—陸封型香魚。

蛋白點a含量差異bP值蛋白名稱登錄號c理論pI/分子量物種覆蓋率蛋白得分總/最佳離子得分15.2350.003NADH脫氫酶gi|515920635.64/28.7非洲爪蟾(Xenopus tropicalis)31332273/78212.8660.006異檸檬酸脫氫酶gi|410546518.35/50.4斑馬魚(Danio rerio)43467317/105328.7110.022NADH脫氫酶gi|512306258.72/53.7斑馬魚38458349/13650.0910.000β-肌動蛋白gi|34522795.46/13.4比目魚(Pseudopleuronectes americanus)70487431/10363.7690.001α-微管蛋白gi|359029194.97/49.9斑馬魚61946768/119713.6460.000熱適應相關蛋白65gi|143885835.58/50.0鯉魚(Cyprinus carpio)169580/6483.5680.001熱休克蛋白60gi|310444895.56/61.2斑馬魚47716628/159110.2820.001鐵蛋白gi|45858165.84/13.6青鳉(Oryzias latipes)23347313/138127.3540.000丙酮酸脫氫酶gi|472103416.2/39.3斑馬魚39232191/68130.0480.000β-肌動蛋白gi|98647805.15/32.0旱獺(Marmota monax)62481364/109140.1020.000氨基?；竒i|2135154845.28/47.0大西洋鮭魚(Salmo salar)9168159/88160.4320.005甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶gi|453616396.02/43.7非洲爪蟾22284256/145172.9510.006異檸檬酸脫氫酶gi|281788328.88/50.9人(Homo sapiens)33181154/59180.290.002過氧化物酶gi|505399965.93/21.8斑馬魚29317243/77190.1210.000丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)移酶gi|470859358.98/46.2斑馬魚2711488/88207.3440.000碳酸酐酶gi|188583797.12/28.7斑馬魚14145138/74210.0320.001丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)移酶gi|470859358.98/46.2斑馬魚58205187/83220.1040.004磷酸烯醇丙酮酸羧激酶gi|470859838.72/69.7斑馬魚1710993/59238.4330.003烯醇酶gi|475513176.25/47.4斑馬魚46728532/138243.2940.001異檸檬酸脫氫酶gi|410546518.35/50.4斑馬魚39172106/402577.4780.000乳酸脫氫酶gi|562662567.75/36.4薄鱗突吻鱈(Coryphaenoides armatus)30383335/85

a編號對應于圖1，差異表達蛋白認定為有2倍以上光密度差異，且P< 0.05；b陸封型和洄游型樣品中對應蛋白點含量的比，以洄游型為分母；c來源于NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。

雙向電泳后采用考馬斯亮藍G-250染色并用PDQuest 2-D軟件進行分析后，發(fā)現(xiàn)體腎組織總可溶性蛋白的雙向電泳圖譜共有25個蛋白點具有顯著性表達差異(t-test,P<0.05)(圖1)，Mascot檢索成功鑒定出21個蛋白點(表2)。和洄游型香魚相比，陸封型香魚體腎組織表達上升的蛋白包括：NADH脫氫酶(點1，3)、異檸檬酸脫氫酶(點2，17，24)、α-微管蛋白(點6)、Wap65(點7)、HSP60(點8)、E1(點12)、碳酸酐酶(點20)、烯醇酶(點23)和乳酸脫氫酶(點25)；陸封型香魚體腎組織表達下調(diào)的蛋白包括：β-肌動蛋白(點5，13)、鐵蛋白(點11)、氨基酰化酶(點14)、甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(點16)、和過氧化物酶(點18)、丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)移酶(點19，21)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(點22)。結果揭示，這些蛋白分別為能量代謝、應激反應、氨基酸代謝和細胞骨架等相關蛋白。

2.2 陸封型香魚體腎組織含量高的蛋白

在鑒定出來的陸封型香魚體腎組織中含量較高的蛋白中，NADH脫氫酶(點1)位于線粒體內(nèi)膜，是一種催化電子從NADH傳遞給輔酶Q的酶。異檸檬酸脫氫酶(點2，17，24)是一種與能量代謝有關的酶，在三羧酸循環(huán)中可以將異檸檬酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸。α-微管蛋白(點6)是構成微管蛋白的一個亞基，參與到微管蛋白的作用中。Wap65(點7)是一種與生物體溫度適應相關的蛋白質(zhì)，且分子量為65 kDa[12]。HSP60(點8) 是HSP蛋白家族的一種，因其在溫度升高時表達量增加且分子量為60 kDa而得名[13]。E1(點12)在生物體內(nèi)催化丙酮酸轉(zhuǎn)變成乙酸輔酶A，此反應是連結糖酵解與檸檬酸循環(huán)的反應。碳酸酐酶(點20)是一種重要的鋅酶，可以催化二氧化碳和水快速生成碳酸根離子和氫離子的反應及其逆反應，維持血液和其它組織的酸堿平衡。烯醇酶(點23)催化從2-磷酸甘油酸形成高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸，是糖酵解中的關鍵酶之一。乳酸脫氫酶(點25)能催化乳酸脫氫生成丙酮酸，是參與糖無氧酵解和糖異生的酶。

2.3 陸封型香魚體腎組織含量低的蛋白

在鑒定出來的陸封型香魚體腎組織中含量較低的蛋白中，β-肌動蛋白(點5，13)是6種肌動蛋白異構體中的一種，而肌動蛋白在肌肉的收縮、細胞的轉(zhuǎn)移與分裂、細胞信號轉(zhuǎn)導及細胞形狀的建立和維持等方面具有重要作用。鐵蛋白(點11)是一種可以貯存和釋放鐵離子的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，其含量反映了細胞內(nèi)鐵離子的貯存量。氨基酰化酶(點14)是一種催化N-?；?L-氨基酸和水反應生成L-氨基酸的酶，這種酶參與尿素循環(huán)和氨基酸代謝。甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(點16)是一種催化ATP和甲硫氨酸合成S-腺苷甲硫氨酸的酶。過氧化物酶(點18)是一類還原過氧化物的酶類，有抗氧化作用。丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)移酶(點19，21)是一種催化丙氨酸和乙醛酸反應生成丙酮酸和甘氨酸的酶，屬于氨基轉(zhuǎn)移酶的一種。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(點22)是糖異生作用中的限速酶，可以催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。

2.4 陸封型和洄游型香魚體腎組織Wap65、HSP60和E1基因mRNA含量差異

由于Wap65、HSP60和E1基因3種蛋白在蛋白質(zhì)組學結果中表達上調(diào)，而且Wap65和HSP60與魚類的環(huán)境應激相關而影響魚類生長[14]，E1與能量代謝相關將直接影響魚類生長，我們也假設這3個蛋白表達變化可能與陸封型和洄游型香魚的體型變化存在緊密聯(lián)系。因此我們采用RT-PCR研究陸封型和洄游型香魚中體腎組織中Wap65、HSP60和E1基因的mRNA表達差異，來驗證蛋白質(zhì)組學的結果。結果表明，和洄游型香魚相比，陸封型香魚的體腎組織中Wap65(11.905倍)、HSP60(3.759倍)和E1(5.236倍)基因的mRNA表達量顯著升高，這與雙向電泳的分析結果一致(圖2)。

圖2 陸封型和洄游型香魚體腎組織中Wap65、HSP60和E1基因mRNA的含量差異

*—顯著性差異(n=4,P<0.05)

3 討論

在此研究中，我們應用雙向電泳和質(zhì)譜技術，來研究洄游型和陸封型香魚體腎組織中蛋白組的差異。研究結果發(fā)現(xiàn)陸封型和洄游型香魚之間存在含量顯著差異的蛋白，而且這些蛋白主要參與能量代謝、應激反應、氨基酸代謝以及構成細胞骨架等過程。

我們的研究結果發(fā)現(xiàn)，一些應激反應相關蛋白在陸封型香魚中表達量較高。研究表明，Wap65在魚類的病原菌感染中發(fā)揮保護作用[12]。而且香魚受到鰻弧菌感染后，Wap65表達量顯著增加，表明Wap65可以作為香魚的一種急性期反應蛋白(Acute phase reaction protein)，參與其應激免疫反應[11]。HSP60是熱休克蛋白(Heat shock protein)的一種，可以參與維持細胞代謝的穩(wěn)態(tài)[13]。近來的研究表明，HSP60通過參與應激免疫反應，在魚類的特異性和非特異性免疫反應中發(fā)揮作用。在魚類的生活環(huán)境中，溫度變化、滲透壓變化及食物等因素可以引起魚類的應激[15]。在我們的研究結果中，陸封型香魚體腎組織中的Wap65和HSP60含量顯著高于洄游型香魚，可能表明陸封型香魚對環(huán)境應激比洄游型香魚更為敏感。由于洄游型香魚生活經(jīng)歷比陸封型香魚豐富，而成年以后其生活環(huán)境與陸封型香魚接近，有論文在動物中的研究發(fā)現(xiàn)生命早期的有益經(jīng)歷會改進動物成年以后對應激的反應[16]，這可能是洄游型香魚相對于陸封型香魚應激蛋白含量低的原因。鐵蛋白和過氧化物酶與機體的抗氧化反應相關[17]。我們的實驗結果中，相比于洄游型香魚，陸封型香魚體腎組織中鐵蛋白和過氧化物酶含量較低，因此可以推測鐵蛋白和過氧化物酶可能也參與了香魚對環(huán)境應激的反應，這兩個蛋白在陸封型香魚表達含量低，可能會造成陸封型香魚對環(huán)境應激反應更強。

魚類的能量代謝和其是否洄游之間存在密切聯(lián)系，洄游過程對其能量代謝存在影響[18]，有研究表明，與非洄游時期相比，一些魚類在進行洄游過程中，能量代謝方式發(fā)生變化[19]。在我們的結果中，陸封型香魚體腎組織中的異檸檬酸脫氫酶、NADH脫氫酶、E1、烯醇酶和乳酸脫氫酶表達量較高，這些酶都是糖酵解和三羧酸循環(huán)中的關鍵酶，可能表明陸封型和洄游型香魚的糖代謝能力發(fā)生了改變。

我們的結果還發(fā)現(xiàn)丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)移酶和甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶在陸封型香魚含量較低。丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)移酶和甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶都是參與氨基酸代謝的酶類。丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)移酶利用丙氨酸和乙醛酸生成甘氨酸和丙酮酸，而生成的甘氨酸，又可以在色氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，生成色氨酸，進而參與一系列的氨基酸代謝過程。甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶催化ATP和甲硫氨酸合成S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)，而這個過程也是甲硫氨酸循環(huán)的限速步驟[20]。這個結果說明，相對于洄游型香魚，陸封型香魚的氨基酸代謝能力可能較弱。這可能與洄游型香魚早期生活在近海，食物中蛋白較為豐富有關。

綜上所述，在陸封型和洄游型香魚的體腎組織中，與能量代謝、應激反應等相關的蛋白質(zhì)的含量具有顯著的差異，可能提示陸封型和洄游型香魚在環(huán)境應激和能量代謝等層面有明顯的差異。我們的研究結果不僅為進一步研究陸封型和洄游型香魚的差異提供了基礎，對陸封型香魚的種群保護和良種培育也具有一定的理論指導意義。

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