朱燕 張富春 馬紀(jì) 黃麗娜 劉小寧

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

核酸免疫制備鼠抗棉鈴蟲FK506結(jié)合蛋白的多克隆抗體

朱燕 張富春 馬紀(jì) 黃麗娜 劉小寧

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

利用電注射基因?qū)敕ㄖ苽湫∈罂姑掴徬xFK506結(jié)合蛋白（FKBP12）的多克隆抗體，并通過Western blot驗(yàn)證抗體與抗原的特異性結(jié)合。構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12并測(cè)序驗(yàn)證序列的正確性，利用基因?qū)敕▽⒅亟M質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12注射到小鼠體內(nèi)，免疫4次后用ELISA檢測(cè)法確定抗體的效價(jià)，并對(duì)抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行Western blot以及免疫組化檢測(cè)。結(jié)果表明，小鼠抗FK506結(jié)合蛋白血清的效價(jià)達(dá)到1∶25 600，Western blot結(jié)果顯示此抗血清能與融合蛋白His-FKBP12結(jié)合，免疫組化結(jié)果表明在棉鈴蟲3齡幼蟲不同組織中FKBP12均有表達(dá)。說明電注射基因?qū)敕ㄖ苽涞男∈罂笷K506結(jié)合蛋白的抗體在滴度和特異性結(jié)合方面都達(dá)到預(yù)期要求。

棉鈴蟲 FK506結(jié)合蛋白 多克隆抗體

FKBP在動(dòng)、植物的各種細(xì)胞中均有分布，含量豐富，大小從12-135 kD不等［1］。除了肽基脯氨?；悩?gòu)酶活性（PPIase）外，很多FKBPs還參與其他一些生理生化活動(dòng)，如基因轉(zhuǎn)錄（FKBP25和FKBP38）、 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 蛋 白 分 泌（FKBP13和FKBP65）［2］、膜結(jié)合表皮生長因子受體（TGFβR）介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)節(jié)（FKBP12）［1］、細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放（FKBP12）及甾體激素受體復(fù)合物的形成（FKBP52）等［3］。

FKBP12是FKBPs家族中的一種重要的胞漿蛋白，到目前為止在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)FKBP12的兩種亞型分別命名為FKBP12和FKBP12.6，這兩個(gè)FKBP12都有108個(gè)氨基酸組成，分子量分別是11.95 kD和11.78 kD。而本實(shí)驗(yàn)組研究的棉鈴蟲

FK506結(jié)合蛋白，分子量在11.88 kD，已有研究表明，棉鈴蟲FKBP12參與棉鈴蟲滯育，20-羥基蛻皮激素能夠誘導(dǎo)發(fā)育，解除滯育，而FKBP12與20-羥基蛻皮激素（20E）的作用相反，參與維持滯育的過程［4］，而在其它昆蟲中還未見相關(guān)報(bào)道。

棉鈴蟲（Helicoverpa amigera）是一種世界性的農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)作物害蟲，棉鈴蟲表現(xiàn)出對(duì)多種殺蟲劑的抗性，且能夠不斷對(duì)新的殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性［5］，導(dǎo)致棉鈴蟲爆發(fā)成災(zāi)，造成農(nóng)作物減產(chǎn)。為有效控制棉鈴蟲抗藥性，減少棉鈴蟲對(duì)農(nóng)作物的危害，本實(shí)驗(yàn)組欲從基因表達(dá)調(diào)控水平闡述棉鈴蟲產(chǎn)生抗性的機(jī)理，以期在基因表達(dá)水平阻斷棉鈴蟲產(chǎn)生抗藥性。已有研究證實(shí)CYP6B6家族基因的表達(dá)與植物次生物質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)有密切關(guān)系［6］，前期本實(shí)驗(yàn)組用一定濃度植物次生物質(zhì)2-十三烷酮處理棉鈴蟲，構(gòu)建了cDNA文庫，經(jīng)酵母單雜交篩選得到FK506結(jié)合蛋白的基因全長。在此基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建pcDNA3-FKBP12重組質(zhì)粒，免疫昆明小鼠制備抗體，經(jīng)Western blot驗(yàn)證抗體能與純化的融合蛋白His-FKBP12特異性結(jié)合［7］，對(duì)3齡幼蟲免疫組化，使抗體與棉鈴蟲不同組織中天然的FKBP12結(jié)合，旨在為深入探究FKBP12在棉鈴蟲體內(nèi)的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與質(zhì)粒 pcDNA3質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存，為真核表達(dá)載體；昆明白小鼠購買于新疆醫(yī)科大第一附屬醫(yī)院。

1.1.2 試劑與儀器 Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、各種限制性內(nèi)切核酸酶均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物來自Thermo Scientific公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購自中衫金橋公司，大腸桿菌DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞購買于北京全式金公司，醋酸纖維素膜是Millipore公司產(chǎn)品，ELISA板購自ET BIOFIL公司，DNA回收試劑盒購自上海生工生物公司，DAB顯色試劑盒購自康為世紀(jì)，其余所用的化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭??；驅(qū)雰x來自上海塔瑞莎健康科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12的構(gòu)建和大量提取 根據(jù)前期篩選得到的FKBP12全長序列，設(shè)計(jì)FKBP12（327 bp）的PCR引物（表1），并用此引物擴(kuò)增得到FKBP12全長序列。用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和pcDNA3質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，將目的片段與載體片段連接并轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單克隆進(jìn)行酶切鑒定后，將鑒定正確的單克隆送至華大基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)正確后大量提取pcDNA3-FKBP12質(zhì)粒，并檢測(cè)質(zhì)粒濃度和純度。

表1 擴(kuò)增FKBP12的引物

1.2.2 小鼠抗FKBP12抗體的制備 取5只昆明小白鼠，用苦味酸對(duì)老鼠進(jìn)行染色標(biāo)記，依次把在右前腿部、右后腿部、頭部、背部、尾部染色的小鼠記為1-5號(hào)小鼠，用TERASA基因?qū)雰x制備FKBP12抗血清。在免疫前取小鼠血清作為陰性血清對(duì)照，并用生理鹽水稀釋重組質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12，使質(zhì)粒的終濃度達(dá)到1 μg/μL，免疫部位為小鼠右后腿肌肉組織，先注射20 μL，濃度為1 μg/μL的pcDNA3-FKBP12質(zhì)粒，而后在同一注射部位給予一定的電流刺激（電壓設(shè)置60 V，脈沖頻率1 Hz，脈沖次數(shù)6次），幫助質(zhì)粒進(jìn)入小鼠肌肉組織內(nèi)部。每隔7 d免疫1次，共免疫4次，每次免疫后對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶采血法收集血清。

1.2.3 ELISA檢測(cè)小鼠抗FKBP12抗體效價(jià) 用濃度為10 μg/mL融合蛋白His-FKBP12于4℃過夜包被ELISA板，次日用PBST緩沖液洗滌3次，5%的脫脂奶粉37℃封閉2 h。再用PBST緩沖液洗滌3次后加入不同稀釋濃度的小鼠血清，37℃孵育1 h。洗滌后以1∶2 000的稀釋比例加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h。PBST洗3次后加TMB底物顯色，避光顯色15 min后，加入2 mol/L的硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450/A655。未免疫前的血清為對(duì)照，其A450/A655值為N；免疫后

的A450/A655值為P，以P/N＞2.1判斷為陽性。

1.2.4 Western blot檢測(cè)FKBP12抗體與抗原特異性結(jié)合 Western blot檢測(cè)參照Bio-Rad公司的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)手冊(cè)，將未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)入pET32a-FKBP12重組質(zhì)粒的BL21菌的總蛋白、經(jīng)鎳柱純化的His-FKBP12融合蛋白進(jìn)行15%的SDS-PAGE電泳，之后采用Mini-PROTEAN 3 Trans-Blot系統(tǒng)（伯樂）轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上，經(jīng)過小鼠抗FKBP12血清和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG孵育后加DAB顯色5 min，顯色結(jié)果用掃描儀進(jìn)行掃描。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)FKBP12在棉鈴蟲體內(nèi)的表達(dá)特征 ①固定：將3齡幼蟲在40 g/L多聚甲醛固定液中固定12 h后制作石蠟切片，切片厚度為4-6 μm。②撈片：石蠟切片撈至經(jīng)多聚賴氨酸（Sigma Diagnostics）預(yù)處理的載玻片上，常規(guī)脫蠟至水；③抗原熱修復(fù)：將PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH7.4）置于微波爐，中高火加熱至沸騰后，再將組織切片浸入其中并調(diào)至低火使保持沸騰狀態(tài)加熱20 min；④0.3 g/L的過氧化氫溶液作用30 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶；⑤封閉：PBS洗后（5 min×3次），0.5 g/L正常山羊血清封閉切片30 min（減少非特異性結(jié)合）；⑥孵育一抗（鼠抗FKBP12多克隆抗體，1∶1 00），4℃過夜，PBS清洗（5 min×3次）；⑦孵育二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記標(biāo)記的山羊抗鼠，1∶1 000），室溫孵育2 h，PBS清洗（5 min×3次）；⑧DAB顯色30 s-5 min（但每張切片顯色時(shí)間保持一致）；⑨脫水，中性樹膠封片。置于光鏡下觀察并拍照。陰性對(duì)照用免前陰性血清替代一抗，其它步驟同上。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12的構(gòu)建

用BamH I和Xho I雙酶切原始FKBP12（327 bp）的PCR產(chǎn)物和pcDNA3質(zhì)粒，得到的酶切片段進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化DH5α。挑取單克隆進(jìn)行酶切鑒定的結(jié)果（圖1）顯示，挑取1-5號(hào)單克隆進(jìn)行菌液PCR均為陽性克隆，從中選取3號(hào)提取質(zhì)粒并雙酶切鑒定，酶切出約330 bp的目的條帶（圖2），表明FKBP12已連接至pcDNA3載體上，重組質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12的菌液PCR鑒定

圖2 重組質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12雙酶切鑒定

2.2 重組質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12的序列比對(duì)和大量提取

將酶切鑒定正確的DH5α-pcDNA3-FKBP12的3號(hào)菌株送至華大基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與原始FKBP12序列進(jìn)行比對(duì)，在核酸水平上有4個(gè)堿基突變（圖3-A），氨基酸序列完全一致（圖3-B），重組質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12產(chǎn)生的FKBP12抗體不會(huì)改變FKBP12的抗原表位，因此可以大量提取重組質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12，用于免疫小鼠。

2.3 ELISA檢測(cè)小鼠抗FKBP12抗體的效價(jià)

在質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12單獨(dú)免疫4次后，用ELISA測(cè)定5只不同小鼠的血清效價(jià)（圖4）。5只小鼠抗血清ELISA檢測(cè)的A450/655值與陰性對(duì)照相比均大于2.1，1-5號(hào)小鼠分別為4.0、3.2、3.6、3.4和3.66，由圖4可知，4次基因免疫后5只小鼠的血清效價(jià)均達(dá)到1∶25 600，說明5只小鼠的抗體滴度均達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，可滿足后續(xù)試驗(yàn)需求。

2.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)多克隆抗體的特異性結(jié)合

用陰性血清和第4次免疫后的抗血清進(jìn)行融合蛋白His-FKBP12的Western blot檢測(cè)，結(jié)果（圖5）

顯示，在抗血清和二抗稀釋的比例為1∶2 000和1∶10 000時(shí)，小鼠抗FKBP12血清與His-FKBP12融合蛋白在33 kD處雜交顯示出條帶，而陰性血清與His-FKBP12融合蛋白雜交在33 kD處沒有條帶，說明4免后的FKBP12抗血清能夠與His-FKBP12融合蛋白特異性結(jié)合。綜上，用基因?qū)雰x免疫小鼠制備的棉鈴蟲FKBP506抗血清能夠與His-FKBP12融合蛋白特異性的結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)棉鈴蟲體內(nèi)天然FKBP12表達(dá)情況，結(jié)果（圖6）顯示小鼠抗FKBP12血清能與棉鈴蟲3齡幼蟲不同組織的FKBP12特異結(jié)合，而陰性血清卻無此特性，說明核酸免疫制備小鼠抗棉鈴蟲FKBP12血清能與天然FKBP12特異結(jié)合，為深入探究FKBP12在棉鈴蟲體內(nèi)的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

圖3 重組質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12的測(cè)序比對(duì)結(jié)果

3 討論

已有大量研究結(jié)果表明，F(xiàn)K506是一類免疫抑制劑，參與免疫抑制，而抑制IL-2的產(chǎn)生是FK506免疫抑制的主要機(jī)制。FKBP12是免疫抑制劑FK506的胞內(nèi)受體蛋白，能參與多種生理作用，如對(duì)T細(xì)胞激活的抑制作用，參與細(xì)胞周期的調(diào)控［1］。FK506-FKBP實(shí)現(xiàn)免疫抑制作用，主要是通過在鈣調(diào)神經(jīng)磷酸化酶（CaN）誘導(dǎo)下，使得活化的T細(xì)胞核因子（NF-AT）的去磷酸化，從而阻礙NF-AT向核內(nèi)遷移，阻斷白介素-2的分泌實(shí)現(xiàn)免疫抑制作用［7］。FK506結(jié)合蛋白與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，參與細(xì)胞周期、細(xì)胞生長發(fā)育、細(xì)胞存活和凋亡以及基因轉(zhuǎn)錄等多種細(xì)胞生命活動(dòng)。FK506可通過與FKBP的結(jié)合，抑制mTOR信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而影響

細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及代謝、細(xì)胞凋亡等過程［8］。棉鈴蟲要經(jīng)過4次完全變態(tài)發(fā)育（歷卵、幼蟲、蛹和成蟲），這些完全變態(tài)發(fā)育過程受到大量細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的精確調(diào)控，而這些細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件目前還沒有研究清楚。2010年，朱佳等［4］經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在棉鈴蟲滯育蛹中FKBP12在mRNA和蛋白水平都有較高表達(dá)，F(xiàn)KBP12參與了棉鈴蟲滯育過程。而在棉鈴蟲滯育過程中TOR基因表達(dá)量較低，推測(cè)FKBP12抑制TOR基因的表達(dá)，進(jìn)而維持滯育，這說明FKBP12能夠響應(yīng)外界不良環(huán)境，參與調(diào)控棉鈴蟲的生長發(fā)育，因此推測(cè)FKBP12可能參與CYP6B6的解毒代謝通路，或者參與棉鈴蟲應(yīng)對(duì)外界不利環(huán)境的調(diào)控。

圖4 ELISA檢測(cè)質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12免疫小鼠4次后的血清效價(jià)

圖5 多克隆抗體與融合蛋白His-FKBP12的特異性結(jié)合的檢測(cè)

圖6 多克隆抗體與棉鈴蟲體內(nèi)天然FKBP12特異性結(jié)合的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)小組構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12，經(jīng)測(cè)序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果在4處出現(xiàn)堿基突變，但翻譯成氨基酸的序列并沒有發(fā)生改變，因此重組質(zhì)粒pcDNA3-FKBP12構(gòu)建成功，用此重組質(zhì)粒對(duì)5只昆明小鼠進(jìn)行質(zhì)粒電注射基因免疫，每隔一周免疫一次，獲得了棉鈴蟲FKBP12的鼠抗血清，用前期純化的His-FKBP12融合蛋白作為抗原，經(jīng)ELISA試驗(yàn)驗(yàn)證免疫4次后抗體效價(jià)，效價(jià)達(dá)到1∶25 600，但5只小鼠產(chǎn)生的抗體還是存在著個(gè)體差異，其中3號(hào)小鼠抗體效價(jià)最高，這可能與小鼠體重生長狀態(tài)有關(guān)，經(jīng)觀察3號(hào)小鼠個(gè)頭較小，在免疫期間體重變化較小，四免時(shí)體重變化較大的2號(hào)小鼠，其產(chǎn)生的抗體效價(jià)相對(duì)較低，這可能是影響抗體效價(jià)的一個(gè)重要原因，因此為避免這類情況，在免疫小鼠制備抗體時(shí)可選擇相對(duì)穩(wěn)定的BALB/c小鼠。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，此血清能靈敏且特異性地與純化的融合蛋白His-FKBP12結(jié)合，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)棉鈴蟲體內(nèi)FKBP12的表達(dá)情況，結(jié)果表明制備的抗FKBP12抗血清能與天然的FKBP12特異結(jié)合，說明FKBP12在3齡幼蟲不同組織中均有表達(dá)。綜上，制備的鼠抗FKBP12多克隆抗體可用來檢測(cè)FKBP12在棉鈴蟲體內(nèi)的時(shí)空表達(dá)規(guī)律及其應(yīng)對(duì)外界不利因素影響下的表達(dá)情況，為詮釋棉鈴蟲細(xì)胞色素P450 CYP6B6的誘導(dǎo)表達(dá)與植物次生物質(zhì)之間關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

用核酸免疫制備了小鼠抗棉鈴蟲FKBP12的多

克隆抗體，用ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)高達(dá)1∶25 600，用Western blot 和免疫組織學(xué)染色法驗(yàn)證了該多克隆抗體能與棉鈴蟲天然蛋白能特異性結(jié)合。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Preparation of the Polyclonal Antibody Against Helicoverpa armigera FK506 Binding Protein by Immunizing with pcDNA3-FK506BP

Zhu Yan Zhang Fuchun Ma Ji Huang Li’na Liu Xiaoning
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

It was to prepare the polyclonal antibody against FK506 binding protein, which was to be to verified the specificity of the antibody by Western blot. Firstly, recombinant expression plasmid pcDNA3-FKBP12 was constructed and sequenced, and the recombinant plasmid pcDNA3-FKBP12 was then transfered into Kunming mice four times. Finally, ELISA assay, Western blot analysis and immunohistochemistry（IHC）were used to determine the titer of polyclonal antibody of FK506 binding protein and its specificity, respectively. The results showed that the titer of polyclonal antibody reached 1∶25 600, and it was able to bind specifically to both the fusion protein His-FKBP12 and FKBP12 from the different tissues of the cotton bollworm in the 3rdlarvae, which laid the foundation for the subsequent experiments.

Helicoverpa armigera FK506 binding protein Polyclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.023

2014-03-31

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260444），自治區(qū)自然基金項(xiàng)目（2012211A018），公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（200903033）

朱燕，女，碩士研究生，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：1069806808@qq.com

劉小寧，女，博士，研究方向：農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治；E-mail：liuxn0103@sina.com