劉倩 齊計(jì)英 韓靜 萬(wàn)閱 鄭士彬

（沈陽(yáng)藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院，沈陽(yáng) 110016）

響應(yīng)面法優(yōu)化回流提取紫薯花青素工藝

劉倩 齊計(jì)英 韓靜 萬(wàn)閱 鄭士彬

（沈陽(yáng)藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院，沈陽(yáng) 110016）

旨在獲得紫薯花青素的最佳提取工藝，采用中心組合（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法，對(duì)紫薯花青素的回流提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，最佳乙醇體積濃度為75%、提取溫度為60℃、提取時(shí)間為60 min、液料比為7∶1，在此基礎(chǔ)上，利用中心組合（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法進(jìn)行回歸分析，獲得最優(yōu)工藝參數(shù)為：乙醇體積濃度74%、提取溫度66℃、提取時(shí)間56 min、液料比8∶1。在優(yōu)化后的條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到紫薯花青素的提取率為4.64 mg/g，與理論值（4.68 mg/g）相比，相對(duì)誤差較小，為0.85%。研究表明，采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化紫薯花青素的水浴回流提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于紫薯花青素的提取生產(chǎn)。

紫薯 花青素 回流提取 中心組合設(shè)計(jì) 響應(yīng)面分析

紫薯（purple sweet potatoes，PSP），俗稱黑紅薯，薯肉呈紫色至深紫色，是新近開發(fā)出的優(yōu)良甘薯品種，其肉質(zhì)紫紅，外觀誘人。其富含蛋白質(zhì)、淀粉、果膠、纖維素、氨基酸、維生素及多種礦物質(zhì)，同時(shí)還富含硒元素和花青素［1］。紫薯花青素是從紫薯的莖葉或塊根中提取出來(lái)的一種水溶性的天然色素，它屬于酚類化合物中的類黃酮類，分子量為287.246，分子式為C15H11O6，基本結(jié)構(gòu)包含一個(gè)黃酮母環(huán)和一個(gè)苯環(huán)，黃酮母環(huán)上和苯環(huán)相連的碳具有手性，因此花青素具有兩種同分異構(gòu)體。近年的研究表明，紫薯花青素具有清除自由基、抗突變、降低高血壓、減輕肝功能障礙的活性［2-4］。另外，紫薯花青素具有抗炎、抗菌、抗紫外線和減輕記憶缺陷的功能［5，6］。紫薯花青素具有純天然效應(yīng)和營(yíng)養(yǎng)功能，應(yīng)用于食品中安全性高，對(duì)人體無(wú)害，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。加之紫薯具有其它作物無(wú)

可比擬的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、適應(yīng)力強(qiáng)等特點(diǎn)，因此開發(fā)紫薯花青素具有很強(qiáng)的原料優(yōu)勢(shì)，紫薯中花青素的應(yīng)用研究已成為熱點(diǎn)。

響應(yīng)面法（Response surface methodology，RSM）是以多元二次回歸數(shù)學(xué)模型為工具，描述相互作用的試驗(yàn)因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系的數(shù)據(jù)處理方法。響應(yīng)面法能有效地找到因素間的最優(yōu)組合，相比于傳統(tǒng)的全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，該法能在更為經(jīng)濟(jì)的試驗(yàn)次數(shù)下，得到精確的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，具有周期短、精確度高等優(yōu)點(diǎn)。回流提取方法相對(duì)于超聲提取、微波提取和超臨界提取等常用提取方法具有操作簡(jiǎn)單、溶劑用量少、設(shè)備成本低、穩(wěn)定性好和易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)乙醇體積濃度、提取溫度、提取時(shí)間、液料比等因素對(duì)紫薯花青素提取率的影響進(jìn)行研究，分析各因素的變化規(guī)律，以期獲得回流法提取紫薯花青素的最佳工藝條件，為紫薯花青素的工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)研究，以便對(duì)紫薯資源進(jìn)一步開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料及試劑 紫薯：購(gòu)于沈陽(yáng)家樂(lè)福超市；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司；濃鹽酸、香草醛、無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 RRHP-200型萬(wàn)能高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，歐凱萊芙（香港）有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-5299，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；電子天平，常熟市金羊天平儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用有限公司。

1.2 方法

1.2.1 花青素含量測(cè)定 紫薯花青素的測(cè)定采用鹽酸-香草醛法［7］。

1.2.2 紫薯花青素的提取工藝 將新鮮紫薯洗凈，經(jīng)過(guò)一定的預(yù)處理得到紫薯干粉。準(zhǔn)確稱取紫薯干粉5 g，按一定的料液比加入到一定體積濃度的乙醇溶液中，在一定溫度下水浴回流提取一定的時(shí)間，真空抽濾后，濾液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至少于50 mL，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中并用相同體積濃度的提取劑定容至刻度，得到待測(cè)液。

1.2.3 紫薯預(yù)處理方式的選擇 紫薯洗凈，按3種方式處理后備用：（1）切片后加鹽脫水、晾干至恒重、粉碎；（2）切片后晾干至恒重、粉碎；（3）切片后放入60℃烘箱中干燥至恒重，粉碎。確定3種處理方式對(duì)紫薯花青素提取率的影響。

1.2.4 最佳提取溶劑的選擇 以甲醇、乙醇和丙酮為提取溶劑，確定不同提取劑對(duì)紫薯花青素提取率的影響。

1.2.5 單因素試驗(yàn) 分別考察乙醇體積濃度、提取時(shí)間、提取溫度、液料比等因素對(duì)花青素提取率的影響。

1.2.6 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［8］，綜合單因素影響試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、液料比（D）四因素為自變量，以紫薯花青素提取率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，并以-1，0，1分別代表變量的因素編碼，變量的因素編碼及水平如表1所示，進(jìn)行水浴回流提取紫薯花青素條件的優(yōu)化。采用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)所取標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度和吸光度數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），經(jīng)數(shù)據(jù)處理分析獲得兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=6.646x+0.020，R2=0.998。

2.2 紫薯預(yù)處理方式的確定

由圖2可知，直接晾干比鹽脫水后晾干和烘干的花青素提取率高。因此，采用將鮮樣品切片后晾

干至恒重、粉碎的方法處理紫薯，進(jìn)一步用于試驗(yàn)。

圖1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 不同處理方法對(duì)花青素提取率的影響

2.3 提取溶劑對(duì)花青素提取率的影響

由圖3可知，提取溶劑為丙酮的花青素提取率比提取溶劑為乙醇的提取率略高，提取溶劑為甲醇的花青素提取率較低。但乙醇比甲醇、丙酮毒性低，且價(jià)格也較之低。所以本試驗(yàn)選擇用乙醇作為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑對(duì)花青素的影響

圖4 各因素對(duì)花青素提取率的影響

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 乙醇體積濃度對(duì)花青素提取率的影響 由圖4-A可知，隨著乙醇體積濃度的增加，紫薯花青素的提取率不斷增加，但當(dāng)乙醇體積濃度在75%-85%

之間時(shí)，花青素提取率沒有太大變化，繼續(xù)增加體積濃度比，花青素提取率明顯下降。而乙醇用量過(guò)多使得生產(chǎn)成本提高，不利于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。因此，最優(yōu)乙醇體積濃度為75%。

2.4.2 提取溫度對(duì)花青素提取率的影響 由圖4-B可知，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，紫薯花青素提取率隨之升高，到60℃時(shí)達(dá)到頂峰，但繼續(xù)升高溫度，提取效果反而降低。因此，60℃為最優(yōu)提取條件。

2.4.3 提取時(shí)間對(duì)花青素提取率的影響 由圖4-C可知，在一定范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的增加，紫薯花青素提取率隨之升高，到1 h時(shí)達(dá)到頂峰，而此后若繼續(xù)反應(yīng)，花青素提取率反而降低。因此，60 min為最優(yōu)提取條件。

2.4.4 液料比對(duì)花青素提取率的影響 由圖4-D可知，隨著液料比的增大，紫薯花青素的提取率增加，但當(dāng)液料比超過(guò)一定范圍后，花青素提取率增加的不再明顯。如圖所示，在7∶1-15∶1之間，其花青素的提取率變化不大。出于節(jié)省原料以及高的液料比對(duì)后續(xù)的濃縮工作不便等因素的考慮，7∶1為最優(yōu)液料比。

2.5 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，乙醇體積濃度為75%、提取溫度為60℃、提取時(shí)間為60 min、液料比為7∶1時(shí)紫薯花青素有最大提取率。紫薯花青素提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.6 模型方程的建立及顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)表2結(jié)果計(jì)算各項(xiàng)回歸系數(shù)，以這些回歸系數(shù)建立紫薯花青素提取率與乙醇體積濃度（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、液料比（D）四個(gè)因素的數(shù)學(xué)回歸模型?；貧w方程中回歸系數(shù)的估計(jì)值見表3。由表2可以得出二次回歸方程式為：紫薯花青素提取率＝4.63-0.072×A+0.11×B-0.035×C+0.17×D+0.034×A×B+0.024×A×C-0.029×A×D-0.046×B×C+0.040×B×D-4.750E-003×C×D-0.30×A2-0.21×B2-0.18×C2-0.27×D2在回歸方程中，B、D變量的正系數(shù)表明，該變量的正向變化能引起響應(yīng)值的增加；A、C變量負(fù)系數(shù)表明，該變量的正向變化能引起響應(yīng)值的減少。負(fù)的二次項(xiàng)系數(shù)表明，方程的拋物面開口向下，具有極大值點(diǎn)，能夠進(jìn)行最優(yōu)分析。

回歸模型方差分析（表3）顯示，試驗(yàn)選用的模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著P=0.092 0＞0.05，說(shuō)明模型是合適的；模型的校正決定系數(shù)R2

Adj=0.927 8，說(shuō)明該模型能解釋92.78%響應(yīng)值的變化；相關(guān)系數(shù)R2=0.963 9，說(shuō)明該模型擬合程度良好，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間有較好的相關(guān)性，試驗(yàn)誤差小，可以用回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

由表3可知模型的一次項(xiàng)B、D影響極顯著，A影響顯著，C影響不顯著。從F值可以看出，單因素對(duì)提取率的影響順序依次是D＞B＞A＞C，即液料比

＞提取溫度＞乙醇體積濃度＞提取時(shí)間。交互項(xiàng)影響不顯著，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2影響極顯著，表明各影響因素對(duì)提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析

2.7 響應(yīng)面交互作用分析與工藝優(yōu)化

對(duì)乙醇體積濃度（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、液料比（D）四因子，兩兩作交互作用分析，對(duì)其作響應(yīng)面圖，分別見圖5-圖10。

圖5 乙醇體積濃度和提取溫度的響應(yīng)曲面和等高線圖

等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。圖7-圖10中等高線呈橢圓形，故乙醇體積濃度和液料比兩因素之間、提取溫度和提取時(shí)間兩因素之間、提取溫度和液料比兩因素之間、提取時(shí)間和料液比兩因素之間交互作用顯著。

在求取最優(yōu)提取條件時(shí)RSM能夠綜合考慮各因素對(duì)2個(gè)響應(yīng)值不同的影響程度及趨勢(shì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)?？傻米罴压に噮?shù)為：乙醇體積濃度74%、提取溫度66℃、提取時(shí)間55 min、液料比8∶1，在此優(yōu)化條件下，花青素的提取率的理論值為4.68 mg/g。為了進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)面分析法的可靠性，采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行花青素提取，重復(fù)3次，測(cè)得紫薯花青素提取率分別為：4.64、4.65和4.64 mg/g，取平均值為4.64 mg/g，與理論值相比，相對(duì)誤差較小，為0.85%。因此，采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化得到的紫薯花青素水浴回流提取的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際操作。

3 討論

本研究首先確定了紫薯的預(yù)處理方式和提取溶劑的選擇，以花青素提取率為指標(biāo)，對(duì)提取過(guò)程中影響花青素提取的乙醇體積濃度、提取溫度、提取時(shí)間和液料比4個(gè)因素，首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察，再采用中心組合（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，建立回歸模型。通過(guò)分析各因素的顯著性和交互作用，優(yōu)化得到紫薯花青素回流提取的最優(yōu)工藝參數(shù)。

紫薯預(yù)處理方式的確定試驗(yàn)結(jié)果顯示，直接晾干比鹽脫水后晾干和烘干的花青素提取率高。出現(xiàn)這種情況的原因可能是花青素存在于細(xì)胞的液泡中，

可能在鹽脫水過(guò)程中破壞了細(xì)胞，使花青素溶出細(xì)胞外，在空氣中氧化，而導(dǎo)致含量降低；加熱會(huì)部分破壞花青素，并且烘干消耗大量的熱能，成本較高。在提取溶劑的選擇試驗(yàn)中，提取溶劑為丙酮的花青素提取率比提取溶劑為乙醇的提取率略高，提取溶劑為甲醇的花青素提取率較低。實(shí)際生產(chǎn)中，用乙醇代替了許多常用的溶劑，如甲醇、丙酮、乙醚，因?yàn)檫@些試劑有毒性，不利于粗提取物在食品和藥品中的進(jìn)一步利用［9］，另外，乙醇能以任意比例與水互溶，能有效溶解花青素，提取液易于保存，過(guò)濾、回收和安全性也比較高，溶劑殘留現(xiàn)象不突出。所以本試驗(yàn)中乙醇可作為提取溶劑的最佳選擇。

圖7 乙醇體積濃度和液料比的響應(yīng)曲面和等高線圖

圖8 提取溫度和提取時(shí)間的響應(yīng)曲面和等高線圖

單因素試驗(yàn)中，乙醇體積濃度、提取溫度和提取時(shí)間的變化趨勢(shì)，提取率先升高然后下降。溫度

的升高，有利于增加乙醇的滲透能力，致使溶劑化的花青素從細(xì)胞內(nèi)向外的擴(kuò)散能力也增加，使得提取率升高；繼續(xù)提高溫度，紫薯花青素會(huì)發(fā)生熱降解，其結(jié)構(gòu)向查耳酮轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致有色結(jié)構(gòu)2-苯并吡喃鹽和醌式假堿減少［10］，提取率降低。在一定時(shí)間內(nèi)，花青素隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷被溶解出，提取時(shí)間愈長(zhǎng)，提取率越高，但擴(kuò)散達(dá)到平衡后，細(xì)胞內(nèi)外濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，故隨著時(shí)間再延長(zhǎng)提取率無(wú)明顯變化；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，由于花青素在加溫溶液中穩(wěn)定性可能隨時(shí)間變化，因此提取時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，花青素因氧化分解反而使含量降低［11］，因此，提取率降低。隨著液料比的增大，紫薯花青素的提取率增加，但當(dāng)液料比超過(guò)一定范圍后，花青素提取率增加的不再明顯。這是因?yàn)閷?duì)于一定量的紫薯粉末來(lái)說(shuō)，溶劑用量的增加降低了溶劑中花青素的濃度，增加了原料與溶劑接觸界面的濃度差，從而提高了花青素與溶劑的擴(kuò)散速度，提取率增大；但是當(dāng)達(dá)到一定比例時(shí)，溶液中花青素的濃度達(dá)到平衡濃度，提取率就不再升高，甚至可能會(huì)減少，因?yàn)槿軇┯昧窟^(guò)大，顆粒細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等物質(zhì)析出，反而不利于花青素的溶出，從而造成提取率的下降。

圖9 提取溫度和液料比的響應(yīng)曲面和等高線圖

圖10 提取時(shí)間和液料比的響應(yīng)曲面和等高線圖

4 結(jié)論

采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面（RSM）分析，建立紫薯花青素色素提取的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型是合理可靠的，能夠較好地預(yù)測(cè)薯花青素提取率。利用模型的響應(yīng)面及其等高線，對(duì)影響薯花青素提取率的關(guān)鍵因素及其相互作用進(jìn)行探討，通過(guò)典型分析并考慮到實(shí)際操作的便利性得到的最終優(yōu)化工藝參數(shù)為乙醇體積濃度74%、提取溫度66℃、提取時(shí)間55 min、液料比8∶1，在此優(yōu)化條件下，花青素的提取率的理論值為4.68 mg/g。為了進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)面分析法的可靠性，采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行花青素提取，重復(fù)3次，測(cè)得紫薯花青素提取率分別為：4.64、4.65和4.64 mg/g，取平均值為4.64 mg/g，與理論值相比，相對(duì)誤差較小，為0.85%。因此，采用響應(yīng)面法分

析優(yōu)化得到的紫薯花青素水浴回流提取的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際操作，能有效減少工藝操作的盲目性。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Optimization of Refluxing Extraction Technology of Anthocyanins from Purple Sweet Potato by Response Surface Method

Liu Qian Qi Jiying Han Jing Wan Yue Zheng Shibin
（School of Pharmaceutical Engineering，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016）

Response surface methodology（RSM）was used to optimize the refluxing extraction process of anthocyanins from purple sweet potatoes as a result of getting the optimum technology. The results of single-factor test showed that the best ethanol concentration was 70%, extraction temperature was 60℃, extraction time was 60 min, liquid-material ratio was 7∶1. Based on these results, the significant parameters were further optimized using Box-Behnken design, RSM and regression analysis. The optimum parameters were：ethanol concentration 74%, extraction temperature 66℃, extraction time 56 min, liquid-material ratio 8∶1. Under such conditions, the extraction efficiency could reach 4.64 mg/g, and have a smaller relative error at 0.85% compared with the theoretical value（4.68 mg/g）. The study showed that the processing parameters achieved from these experiments were accurate and can be applied to the extraction and production of anthocyanins from purple sweet potatoes.

Purple sweet potatoes Anthocyanin Refluxing extraction central Composite design Response surface methodology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.016

2014-05-12

劉倩，女，碩士，研究方向：天然活性物質(zhì)的提取與制劑研究；E-mail：18604019826@163.com

韓靜，女，博士，研究方向：天然活性物質(zhì)分離提取應(yīng)用研究，納米技術(shù)制藥與工程研究；E-mail：HJ-8080@163.com