馮學珍 伍善廣 陸苑

（廣西科技大學，柳州 545006）

應用PCR-DGGE技術研究石莼、網地藻藻際微生物多樣性

馮學珍 伍善廣 陸苑

（廣西科技大學，柳州 545006）

應用變性凝膠梯度電泳（PCR-DGGE）技術對石莼、網地藻藻際微生物多樣性進行研究，并對其進行相似性、未加權聚類分析（UPGMA）及微生物多樣性（Shannon）指數(shù)分析。結果表明，PCR-DGGE圖譜顯示，石莼、網地藻藻際微生物DGGE圖譜有著明顯的差異性，具體表現(xiàn)在條帶數(shù)及密度值的不同。Quantity one圖譜分析表明：石莼藻際微生物16S rRNA基因的V3區(qū)共分離得到25條DNA片段，網地藻為16條DNA片段。 DGGE相似性及未加權聚類分析表明：網地藻藻際微生物間的相似性為77.78%，石莼藻際微生物細菌群落間的相似性為49.25%。Shannon指數(shù)分析表明，石莼藻際微生物多樣性指數(shù)顯著高于網地藻（P＜0.05）。石莼藻際微生物細菌群落較網地藻豐富。

變形凝膠梯度電泳（PCR-DGGE） 石莼 網地藻 藻際微生物 微生物多樣性

藻際環(huán)境（Phycospere）是指由藻類新陳代謝過程中分泌的胞外產物形成的特殊的自藻類細胞向外到一定距離的區(qū)域［1］，由于細菌對藻類胞外產物有趨化性，不同藻類產生的胞外產物不同可能導致藻際環(huán)境中所生長的細菌種類的不同［2，3］。因此，在藻際環(huán)境里形成了具有一定結構和功能的、并與藻類存在相互作用的藻際微生物細菌群落［4］。因此，海洋微藻在生長過程中向周圍環(huán)境分泌多種胞外產物，形成細菌自由生長的藻際環(huán)境［5］，藻際細菌對石莼（Ulva lactuca L.）、網地藻等藻類的生長有一定

的調控作用。

研究藻際微生物不僅對藻類的生長有重要意義，對藻類藥物的開發(fā)也具有非常大的應用前景。海藻是生長于海洋的低等植物，不僅營養(yǎng)價值高且具有多種生物活性，在食品、藥品等領域都得以廣泛應用，成為眾多學者研究的重點［6］。例如，海藻多糖類化合物，因其獨特的生物活性和較低的毒性，已成為當今新藥的研究方向之一［7］。本研究擬采用PCR-DGGE技術對廣西海域的石莼、網地藻藻際微生物細菌群落多樣性進行分析，以期為石莼、網地藻的生長及藻類多糖化合物的研究提供數(shù)據(jù)支持與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

石莼于2011年8月采自廣西北部灣海域（21° 40' 30″ N，109° 11' 35″ E），經大連海洋大學邢坤副教授鑒定為綠藻門石莼屬黑石礁石莼；網地藻于2012年05月采自廣西北部灣海域（20° 54' 10″ N，109° 05' 20″ E），經中國科學院南海海洋研究所雷新明博士鑒定為鹿角網地藻（Dictyota cervicornis）的新鮮藻體。采集樣品一部分用于海藻多糖的研究，一部分置于-70℃用于分子指標的測定（DNA的提取、聚合酶鏈反應、變性凝膠梯度電泳）。

1.2 方法

1.2.1 藻際微生物DNA的提取 將已鑒定的石莼、網地藻樣品進行藻際微生物基因組DNA的提取，以便后續(xù)分析。從0.1 g樣品中進行藻際微生物DNA的提取，采用植物基因組DNA提取試劑盒（Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN）。為保證基因組DNA的質量，取少量DNA樣品一部分用于濃度和純度的測定（Nanodrop，PeqLab，Germany），一部分進行1%含溴化乙錠瓊脂糖凝膠電泳（100 V，40 min），在紫外凝膠成像系統(tǒng)下拍照檢測。剩余DNA樣品保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA的聚合酶鏈反應 將提取得到的藻際微生物DNA作為聚合酶鏈反應（PCR）的模板，使用ABI的PCR system 9700型基因擴增儀，采用對大多數(shù)細菌的16S rRNA基因V3區(qū)具有特異性的引物對F984GC和R1378（Muyzer，1993）［8］，序列分別為：F984GC：5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCG GGCGGGGCGGGGGCAAACGCGAAGAACCTTAC-3'）R1378：5'-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3'，擴增產物片段長約400 bp。（下劃線部分為“GC夾”）

50 μL的反應體系組成如下：100 ng的DNA模板，5 μL的10×buffer（含MgCl2），200 μmol/L的dNTPs，0.5 μ mol/L的上下游引物，2.5 U的Taq酶，加ddH2O補足至50 μL。

PCR反應采用普通PCR，即預變性94℃ 5 min，中間采用35個循環(huán)為 94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃90 s，最后在72℃下延伸5 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 變性凝膠梯度電泳（PCR-DGGE） 采用Biorad公司的DCodeTM的基因突變檢測系統(tǒng)對PCR產物進行電泳分離。變性較的制備采用Bio-rad公司的DCode試劑盒。具體操作如下：使用梯度膠制備裝置，制備變性劑濃度從30%到70%（100%的變性劑為7 mol/L尿素和40%去離子甲酰胺的混合物）的10%聚丙烯酰胺凝膠，其中變性劑的濃度從膠的上方向下方依次遞增。在1×TAE中，60 V預電泳1 h，100 V電泳15 h后，取出，銀染后在凝膠紫外自動成像系統(tǒng)中拍照（SYNGENE Inc，USA）。銀染的具體步驟如下：電泳完畢后，用10%乙醇、0.5%冰醋酸浸泡10-15 min進行固定；加銀染液，搖床震蕩染色15 min；用去離子水漂洗兩次后，加3% NaOH、0.5%甲醛顯色10 min，待條帶顯現(xiàn)后立即拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用Quantity one軟件（條帶識別容忍度1%）對PCR-DGGE圖譜進行處理，基于條帶的有無以獲得各泳道（樣品）的相似性，進行數(shù)學未成對加權聚類分析（UPGMA），以及Shannon指數(shù)的計算。其中，Shannon指數(shù)計算公式為：H = -（ni/N）log（ni/N），ni為峰面積，N為所有峰的總面積［9，10］。

利用ANOVA分析比較樣品的微生物多樣性。所有數(shù)據(jù)均在Excel 2007軟件中整理，利用SPSS 2.0軟件完成。

2 結果

2.1 總DNA的提取量

總DNA提取量24.66-91.67 μg/g干樣，見表

1，其中石莼顯著高于網地藻。測定所提總DNA的A260 nm/A280 nm比值為1.8-1.9，A260 nm/A230 nm比值為1.8-2.0，總DNA片段大小約為20 kb（圖1），說明所提取的總DNA產量和純度均較高，可用于進一步的分子生物學分析。

表1 藻際微生物總DNA提取量

圖1 總DNA電泳圖

2.2 石莼、網地藻藻際微生物的PCR-DGGE圖譜

從圖2可以看出，DGGE泳道中的條帶存在差異，石莼藻際微生物DGGE電泳條帶數(shù)目遠高于網地藻藻際微生物，且條帶的灰度也較深，其中石莼與網地藻藻際微生物的差異條帶較多，說明石莼、網地藻藻際微生物在群落結構組成有明顯差異。根據(jù)DGGE對不同DNA片段分離原理可知，石莼、網地藻的PCR產物中含有多種數(shù)目不等的不同DNA片段，屬于藻際微生物16S rRNA基因V3的片段，如果對這些片段加以切膠、純化、克隆測序，即可知DGGE中被分離出的DNA片段所代表的具體種屬關系，從而確定石莼、網地藻藻際微生物所含有的細菌種類。

圖2 石莼、網地藻藻際微生物DGGE分離圖譜

2.3 石莼、網地藻藻際微生物DGGE條帶差異分析

利用Quantity one軟件對DGGE圖譜進行分析，輸出條帶差異圖如圖3所示，條帶數(shù)列表如表2所示。從表2，圖3可以看出利用PCR-DGGE技術對石莼藻際微生物16S rRNA基因的V3區(qū)片段進行分離，共得到25條DNA片段，網地藻藻際微生物共分離得到16條DNA片段，分離得到的DNA片段數(shù)石莼顯著高于網地藻（P＜0.05）。

圖3 石莼、網地藻藻際微生物DGGE條帶差異圖

表2 石莼、網地藻藻際微生物DGGE條帶數(shù)

2.4 石莼、網地藻藻際微生物的相似性及未加權聚類分析（UPGMA）

從圖4的石莼、網地藻藻際微生物相似性及

UPGMA圖分析結果可以看出：網地藻藻際微生物間的相似性為77.78%，石莼藻際微生物細菌群落間的相似性為49.25%。說明網地藻藻際微生物細菌群落多樣性低于石莼藻際微生物細菌群落多樣性。

圖4 石莼、網地藻藻際微生物的相似性及UPGMA圖

2.5 石莼、網地藻藻際微生物多樣性（Shannon）指數(shù)分析

根據(jù)DGGE圖譜中條帶的數(shù)量和灰度計算石莼、網地藻的藻際微生物多樣性Shannon指數(shù)結果見表3。其中石莼藻際微生物的Shannon指數(shù)為0.973-0.989，網地藻藻際微生物的Shannon指數(shù)為0.416-0.452。利用ANOVA分析比較石莼、網地藻藻際微生物多樣性發(fā)現(xiàn)，石莼藻際微生物多樣性比網地藻較為豐富，多樣性指數(shù)顯著高于網地藻（P＜0.05）。

表3 石莼、網地藻樣品DGGE條帶的Shannon指數(shù)

3 討論

本文石莼、網地藻均采集于廣西北部海灣，應用PCR-DGGE技術對石莼、網地藻藻際微生物多樣性進行了研究，其分離出數(shù)目不等、位置各異的16S rRNA基因的V3區(qū)片段，每一個條帶代表群落中的一個可操作分類單元［11］，條帶數(shù)越多說明多樣性越豐富，結果說明同一海域不同經緯度下的藻際微生物存在差異，具體表現(xiàn)為石莼藻際微生物細菌群落多樣性較網地藻豐富，分析原因可能是由于不同經緯度下海域的溫度、鹽度等環(huán)境因素有關，而石莼、網地藻等藻類本身的性質也會對藻際微生物的細菌群落結構產生差異。

前期對石莼、網地藻的多糖提取率進行了測定，其中石莼多糖提取率顯著高于網地藻，且單糖組成存在差異［12，13］。結合PCR-DGGE分析結果可以看出，藻際微生物細菌群落多樣性與藻類多糖息息相關，分析原因可能是由于藻類胞外物多糖的分泌能夠為藻際微生物的生長提供碳源，從而使得石莼細菌群落多樣性高于網地藻；同時藻際微生物的豐富又為藻類的生長與培育具有一定的調控作用。有研究顯示：細菌利用藻類產生的有機物質，而其經過細菌代謝后有可以形成較為簡單的無機物或者有機物，這些物質又可以為藻類的生長提供營養(yǎng)物質和生長因子，從而調節(jié)藻類的生長［14］，因此藻際微生物細菌群落多樣性與藻類多糖間相互作用相互影響，研究藻際微生物的豐富度對藻類多糖的提取提供一定的科學依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

4 結論

本研究依據(jù)PCR-DGGE技術初步研究表明比較了石莼、網地藻間藻際微生物細菌群落結構的差異：石莼細菌群落多樣性顯著高于網地藻，但最終要確定具體某一種屬微生物對藻類及胞外產物起重要作用，還需進一步的研究。

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（責任編輯 狄艷紅）

Preliminary Application of PCR-DGGE to Analyzing Microbial Diversity of Ulva lactuca L. and Dictyota dichotoma

Feng Xuezhen Wu Shanguang Lu Yuan
（Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006）

To study the microbial diversity of Ulva lactuca L. and Dictyota dichotoma. As a new DNA fingerprinting technique, denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）can be used to analyze the microbial diversity in different environmental samples. Ulva lactuca L. and Dictyota dichotoma will be studied with respect to microbial diversity by applying cultivation-independent molecular methods DGGE. The results showed, the profile of DGGE showed that Ulva lactuca L. and Dictyota dichotoma had different bands. The structural diversity of the microbial community was examined by the Shannon index of general diversity H. Quantity one analysis showed that, V3 region of 16S rRNA gene was isolated from 25 DNA fragments of Ulva lactuca L. and 16 of Dictyota dichotoma. DGGE similarity and UPGMA analysis showed that：the similarity of Ulva lactuca L. was higher than the Dictyota dichotoma（P＜0.05）.. Shannon indexes of two kinds of algae all showed Ulva lactuca L. were significantly higher than the Dictyota dichotoma（P＜0.05）. The algae microbial diversity of Ulva lactuca L. was richer than Dictyota dichotoma.

PCR-DGGE Ulva lactuca L. Dictyota dichotoma Algae microorganisms Microbial diversity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.012

2014-05-21

廣西壯族自治區(qū)教育廳級課題(2013LX180)，廣西高等學校特色專業(yè)及課程一體化建設項目（藥學GXTSZY286）

馮學珍，女，碩士，講師，研究方向：海洋生物活性物質的研究與開發(fā)；E-mail：fengxuezhenbest@163.com

伍善廣，男，博士，副教授，研究方向：天然產物的分離純化及藥物新劑型；E-mail：510242227@qq.com