范晶李仲芳，2高明輝伏秦超

（1. 樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，樂山 614004；2. 天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，天水 741001）

一種適用于RAPD分析的微量山茶DNA提取方法的建立

范晶1李仲芳1，2高明輝1伏秦超1

（1. 樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，樂山 614004；2. 天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，天水 741001）

為建立一種滿足RAPD-PCR分析的簡便且高產(chǎn)率微量山茶基因組DNA提取方法，探索了在無液氮條件下，采用簡化試驗(yàn)步驟的改良CTAB、SDS和Triton X-100方法分別提取山茶新鮮和干燥葉片DNA，通過光譜掃描和測(cè)定DNA在波長230 nm，260 nm和280 nm時(shí)的吸光度，比較不同DNA提取方法、材料保存方法以及材料用量對(duì)DNA提取效率的影響。結(jié)果表明，干燥葉片比新鮮葉片更適合作為DNA提取材料，改良CTAB法在提取干燥山茶DNA時(shí)純度和產(chǎn)率較理想，其A260/A280值為1.595-1.736，每克葉片可得到230-295 μg DNA，高質(zhì)量DNA經(jīng)RAPD-PCR擴(kuò)增可獲得清晰擴(kuò)增條帶。100 mg干燥山茶葉片適合獲得高純度和高產(chǎn)率的DNA，增加材料用量可增大DNA總量，但也增加了DNA中雜質(zhì)含量。

DNA提取 RAPD 山茶 改良CTAB方法

山茶（Camellia japonica L.）屬于山茶科山茶屬常綠灌木，是原產(chǎn)于中國的珍貴花卉，在中國十大名花中排名第七，具有很高的景觀價(jià)值，廣泛應(yīng)用于園林綠化、室內(nèi)盆栽、立體景觀和插花藝術(shù)。我

國山茶主要集中在云南、四川、廣西和廣東等地，川茶花分布于四川盆地，品種繁多，占據(jù)了全國山茶20%的資源，在中國茶花中獨(dú)具一格［1］。樂山位于四川盆地西南部，介于北緯2828-2956，東

經(jīng)10215'-10415'，是全國綠化模范城市、中國優(yōu)秀旅游城市和國家園林城市。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，樂山現(xiàn)發(fā)現(xiàn)63個(gè)山茶品種，其中包括珍貴的峨眉紅山茶、怒江紅山茶、金沙江紅山茶和杜鵑紅山茶等山茶原種資源［2］。關(guān)于樂山地區(qū)山茶的研究，目前主要集中在資源調(diào)查和利用同工酶酶譜進(jìn)行分類學(xué)研究［3，4］。然而，樂山山茶遺傳多樣性方面還缺少系統(tǒng)研究?？焖佾@得高質(zhì)量和高產(chǎn)率DNA是開展山茶群體遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性分析的重要前提，常規(guī)DNA提取方法通常包含液氮研磨樣品、反復(fù)離心抽提、乙醇沉淀和洗滌DNA等步驟，上述過程操作步驟較多，在進(jìn)行大規(guī)模樣品的DNA提取時(shí)工作量較大，不能適應(yīng)大批量樣品的快速檢測(cè)。山茶還富含多糖、多酚及其他次生代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)可嚴(yán)重干擾所提取DNA的產(chǎn)率及質(zhì)量［5］。本研究在參考已報(bào)道常規(guī)CTAB、SDS和Triton X-100 DNA提取方法基礎(chǔ)上［6-8］，通過簡化試驗(yàn)步驟和替換部分實(shí)驗(yàn)試劑，探索了改良的DNA提取方法，同時(shí)通過比較不同DNA提取方法、不同材料保存方法和不同材料用量對(duì)DNA提取效果的影響，最終建立了一種簡便、高產(chǎn)率的微量山茶DNA提取改良方法，為后續(xù)開展樂山地區(qū)山茶群體遺傳多樣性研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試山茶材料有七心紅山茶、浙江紅山茶、四季紅山茶、梔子茶、復(fù)色驕傲、復(fù)色三月茶、三月茶和窄葉西南。PCR buffer、MgCl2、Taq DNA聚合酶、dNTPs等RAPD-PCR反應(yīng)試劑購自Takaka公司，隨機(jī)擴(kuò)增引物序列為5'-TGATCCCTGG- 3'，由上海英俊公司（Invitrogen）合成，其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 DNA提取方法參考已發(fā)表文獻(xiàn)［6-8］，并對(duì)操作步驟進(jìn)行了優(yōu)化，主要體現(xiàn)在免去常規(guī)DNA提取時(shí)使用液氮、采用更常規(guī)和經(jīng)濟(jì)的石英砂進(jìn)行樣品研磨；減少氯仿/異戊醇等試劑抽提和離心取上清次數(shù)；減少材料用量以便降低DNA中雜質(zhì)含量；為減少所獲得微量DNA的損失，在異丙醇沉淀DNA后，采用無水乙醇代替75%乙醇洗滌DNA 1次。

改良CTAB法參考已發(fā)表文獻(xiàn)并加以改良［6］。取石英砂磨碎后的100 mg山茶葉片，放入1.5 mL Eppendorf管中，加入750 μL 65℃預(yù)熱的2% CTAB提取液和15 μL β-巰基乙醇，輕輕上下顛倒混勻后放置65℃水浴鍋中保溫50 min，期間每隔10 min左右搖勻1次。從水浴鍋中取出離心管，加入450 μL氯仿∶異戊醇（24∶1）進(jìn)行抽提，搖勻后12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移500 μL上清液至一個(gè)干凈離心管中，加入10%體積的3 mol/L醋酸鈉溶液和等體積的預(yù)冷異丙醇，混勻后于-20℃放置2 h沉淀DNA。12 000 r/min離心10 min棄上清，所獲得DNA沉淀用500 μL無水乙醇洗滌一次，12 000 r/min離心5 min后去除無水乙醇，于空氣晾干DNA沉淀，溶解于50 μL無菌水并保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

改良SDS法參照分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)并加以改良［7］。取100 mg石英砂磨碎的山茶粉末葉片裝入1.5 mL Eppendorf中，加入750 μL經(jīng)65℃預(yù)熱的SDS細(xì)胞DNA提取液，上下顛倒輕輕混勻，65℃水浴50 min，期間每10 min左右將離心管搖勻1次，將離心管從水浴鍋中取出并加入235 μL的5 mol/L KCL溶液，冰浴20 min后12 000 r/min離心5 min，將750 μL上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1）進(jìn)行DNA抽提，12 000 r/min離心10 min后取上清并轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加等體積預(yù)冷異丙醇，-20℃放置2 h沉淀DNA，后續(xù)步驟同改良CTAB法。

改良Triton X-100法參照并改良了田杰的方法［8］。取石英砂研磨的山茶葉片粉末100 mg裝入1.5 mL Eppendorf管中，加入750 μL的Triton X-100 DNA提取液，輕輕混勻后放置65℃水浴50 min，每10 min左右搖勻1次，之后從水浴鍋中取出離心管，加入60%體積的氯仿/異戊醇（24∶1）混勻，12 000 r/min離心10 min取500 μL上清，加等體積異丙醇并混勻，-20℃放置2 h沉淀DNA，后續(xù)步驟同改良CTAB法。

1.2.2 DNA提取效果檢測(cè) 分別取10 μL改良CTAB、SDS和Triton-X100法提取的DNA，轉(zhuǎn)入比色皿中并用無菌水補(bǔ)至2 mL，使用UV1901紫外分光光度計(jì)測(cè)量230 nm、260 nm和280 nm波長時(shí)吸

光度判斷DNA的濃度及產(chǎn)率，根據(jù)A260nm/A280nm、A260nm/A230nm比值判斷所制備DNA的純度，參考吳波等文獻(xiàn)計(jì)算DNA的濃度和產(chǎn)率，DNA濃度（μg/mL）=稀釋倍數(shù)×OD260×50，DNA產(chǎn)率（μg/g）=DNA濃度（μg/mL）×體積（mL）/葉片重量（g）［9］。

1.2.3 RAPD-PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳 RAPDPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中含1×PCR Buffer、200 μmol dNTP、2 mmol MgCl2、0.8 μmol上下游引物、lU Taq DNA聚合酶和1 μL DNA模板。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸2 min，共45個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%濃度的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 提取方法對(duì)DNA提取效果的影響

為了確定適合微量山茶葉片DNA提取的方法，我們采用改良CTAB、SDS和Triton X-100方法分別提取100 mg七心紅山茶葉片DNA，通過紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA光譜掃描和測(cè)定230 nm、260 nm和280 nm波長時(shí)的吸光度。結(jié)果顯示3種方法中，改良Triton X-100方法的DNA產(chǎn)率最高，改良CTAB方法次之，改良SDS方法最低。但在DNA純度方面，A260/A280和A260/A230比值顯示改良CTAB方法＞改良Triton X-100方法＞改良SDS方法（表1），該結(jié)果和DNA光譜掃描結(jié)果一致（圖1）。改良的CTAB方法（圖1-a）和改良SDS方法（圖1-b）提取的DNA光譜掃描結(jié)果顯示兩者在波長260 nm時(shí)均有一個(gè)比較明顯的DNA吸收峰，說明均成功提取到DNA。但改良SDS方法提取的DNA在230 nm和280 nm波長時(shí)還分別有一個(gè)比較明顯的吸收峰，說明DNA中含有一定比例的鹽、糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)（圖1-b）。而Triton X-100提取的DNA光譜掃描結(jié)果顯示掃描曲線偏離基線較嚴(yán)重，說明提取物中除了含有較高濃度的DNA外，還含有較高濃度的雜質(zhì)（圖1-c），綜合來看，改良CTAB方法最適合作為微量山茶DNA的提取方法。

表1 不同方法對(duì)DNA提取效果的影響

2.2 材料保存方法對(duì)DNA提取效果的影響

為了探明山茶保存狀態(tài)對(duì)DNA提取的影響，本研究采用改良CTAB法分別提取200 mg新鮮葉片和干燥葉片的DNA。光譜掃描結(jié)果顯示干燥葉片（圖1-d）和新鮮葉片（圖1-e）提取物在260 nm處均有吸收峰，說明均能提取DNA，DNA吸光度結(jié)果表明干燥葉片DNA產(chǎn)率高于新鮮葉片，且干燥葉片A260/A280比值大于新鮮葉片對(duì)應(yīng)比值（表1），表明干燥葉片更適合作為DNA提取材料。

2.3 材料用量對(duì)DNA提取效果的影響

為了探索山茶用量對(duì)提取DNA的影響，我們采用改良的CTAB方法分別提取了100和200 mg山茶干燥葉片DNA。結(jié)果顯示，增加材料的用量可以雖然可以增加提取DNA的總量（表1），但會(huì)導(dǎo)致DNA中雜質(zhì)含量增多，光譜掃描結(jié)果圖1-a顯示100 mg山茶葉片提取的DNA在波長260 nm時(shí)有一個(gè)比較明顯的DNA吸收峰。圖1-d顯示200 mg山茶葉片提取產(chǎn)物在230 nm、260 nm和280 nm波長處各有一個(gè)比較明顯的DNA吸收峰，說明提取的DNA中含有較大含量的雜質(zhì)，其純度低于100 mg葉片提取的DNA，因此，控制材料用量是獲得高純度DNA的關(guān)鍵。

2.4 RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果

為了驗(yàn)證改良CTAB方法提取的DNA能否滿足分子標(biāo)記遺傳學(xué)分析，我們提取了7個(gè)硅膠干燥且低溫保存時(shí)間長達(dá)131 d的山茶葉片基因組DNA，

采用一個(gè)隨機(jī)擴(kuò)增引物對(duì)其進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增。圖2結(jié)果顯示，以7個(gè)山茶樣品的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，均能得到清晰的DNA條帶并顯示出基因多態(tài)性，說明本研究建立的改良CTAB法適用于山茶分子遺傳標(biāo)記分析。

圖1 3種方法提取DNA的光譜掃描結(jié)果

圖2 7個(gè)山茶樣品的RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

分子標(biāo)記技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種和系統(tǒng)進(jìn)化研究，由于研究時(shí)需要涉及到較大數(shù)量樣品，因此，建立一種操作步驟簡單的適合較大群體遺傳分析的DNA提取方法受到廣大研究人員的重視［10］。目前，通過已有文獻(xiàn)報(bào)道的方法能夠提取出山茶DNA并進(jìn)行遺傳標(biāo)記分析［11，12］，但普遍存在使用液氮和操作步驟復(fù)雜等可改進(jìn)之處，同時(shí)不同DNA提取方法還存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)和最佳應(yīng)用范圍。劉嬋等［13］采用CTAB、改良CTAB、SDS、改良SDS 4種方法提取滇山茶基因組DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改良CTAB為最佳DNA提取方法，SDS法不能較好提取DNA，他們?cè)谶\(yùn)用改良CTAB方法提取DNA時(shí)，首先采用液氮磨碎樣品，然后用氯仿-異戊醇-乙醇溶液抽提上清2-3次，RNaseA消化去除RNA，最后采用99.5%的冷乙醇沉淀DNA，76%的乙醇洗滌DNA，操作步驟相對(duì)較為復(fù)雜。Yang等［14］采用改良SDS法提取大果油茶嫩葉基因組DNA，通過添加高濃度醋酸鉀溶液沉淀蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和RNA、70%乙醇洗滌DNA去除鹽等雜質(zhì)以及RNA酶消化DNA中的RNA等步驟，獲得進(jìn)行ISSR-PCR分析的DNA。本研究采用3種簡化試驗(yàn)步驟的改良CTAB、SDS和Triton X-100方法提取DNA，結(jié)果顯示改良的CTAB、SDS和Triton-X100三種方法均能成功提取出微量山茶DNA，但以改良CTAB方法提取的DNA效果最佳（表1，圖1）。在本研究改良CTAB方法中，改進(jìn)步驟主要表現(xiàn)為采用常用的石英砂代替液氮對(duì)材料進(jìn)行研磨，減少氯仿/異戊醇

抽提和離心取上清次數(shù)，在進(jìn)行DNA沉淀時(shí)，采用異丙醇代替乙醇進(jìn)行DNA沉淀，主要是考慮了2個(gè)因素：第一，異丙醇沉淀DNA效率高于乙醇；第二，異丙醇沉淀可減少DNA受多糖和雜蛋白污染的程度。由于提取DNA時(shí)使用的是微量材料，為減少DNA的損失，我們還對(duì)2個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行了改進(jìn)：第一，異丙醇沉淀DNA時(shí)加入10%體積的3M醋酸鈉溶液，其原理是用陽離子Na+可中和DNA分子上的負(fù)電荷，以便降低DNA分子之間的同種電荷排斥力，促進(jìn)DNA發(fā)生聚合并形成沉淀。第二，我們采用無水乙醇代替75%乙醇洗滌DNA，一方面可以減少DNA再次溶解于水而導(dǎo)致進(jìn)一步損失；另一面是考慮到沉淀DNA的異丙醇不容易揮發(fā)，而無水乙醇揮發(fā)更快，可促進(jìn)DNA更快干燥。

高質(zhì)量基因組DNA的獲得是進(jìn)行山茶分子遺傳多樣性研究的關(guān)鍵步驟，由于山茶細(xì)胞內(nèi)含有大量的多糖、酚類和色素等物質(zhì)［15］。它們可干擾所獲得基因組DNA的質(zhì)量，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗，而通過減少材料用量來降低DNA中雜質(zhì)含量是較好的選擇。試驗(yàn)中我們以100和200 mg山茶葉片為材料進(jìn)行DNA提取，結(jié)果顯示100和200 mg材料均能獲得較高DNA產(chǎn)率，每克葉片DNA可分別達(dá)到295 μg和230 μg。譚曉風(fēng)等［16］采用改良CTAB法提取32個(gè)山茶DNA時(shí)，每克葉片DNA提取產(chǎn)率最高為110 μg。倪穗等［17］采用改良CTAB法提取紅山茶基因組DNA時(shí)，每克鮮組織可得到50 μg左右的總DNA。

野外采集材料往往存在一些客觀條件制約，表現(xiàn)尤為突出的是所采集的樣品不能及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，因此試驗(yàn)樣品的處理和保存對(duì)于成功開展后續(xù)分析具有重要的意義。林立等［18］在進(jìn)行中日5個(gè)島嶼山茶種群遺傳多樣性研究時(shí)，采用冰袋對(duì)山茶嫩葉進(jìn)行保鮮運(yùn)輸。周阿濤等［19］在進(jìn)行云南山茶序列多態(tài)性分析時(shí)，DNA提取時(shí)使用的樣品是常溫保存且變色硅膠干燥的山茶新鮮葉片。本研究中，同時(shí)比較了新鮮葉片和硅膠干燥葉片的DNA提取效果，發(fā)現(xiàn)硅膠干燥葉片提取DNA的產(chǎn)率和純度均優(yōu)于新鮮葉片。駱文華等［20］在提取廣西火桐基因組DNA時(shí)也得到類似結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)保存時(shí)間90 d的硅膠干燥葉片的DNA產(chǎn)率高于新鮮葉片，但DNA純度相當(dāng)。代文娟等［21］認(rèn)為硅膠干燥保存時(shí)間在10 d至l0個(gè)月之間的植物葉樣最適合提取DNA，此階段樣品所得DNA得率高且純度較好。本研究應(yīng)用改良CTAB方法提取了7個(gè)保存時(shí)間為131 d的硅膠干燥山茶樣品的基因組DNA，RAPDPCR結(jié)果顯示各個(gè)樣品提取的DNA能夠擴(kuò)增出條帶并顯示出較好的遺傳多樣性。本研究為下一步開展樂山山茶群體遺傳結(jié)構(gòu)研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

采用光譜掃描和測(cè)定DNA吸光度比較改良CTAB、SDS和Triton X-100法提取山茶DNA的效率，結(jié)果表明本研究的建立的改良CTAB法適合作為山茶DNA的提取方法，DNA完整性較好，A260/A280值介于1.595-1.736，DNA產(chǎn)率較其他文獻(xiàn)報(bào)道方法有較大提高，每克葉片DNA含量可達(dá)230-295 μg。干燥葉片比新鮮葉片更適合作為DNA提取材料，在無液氮條件下，采用改良CTAB法提取100 mg山茶干燥葉片DNA，所得DNA的純度和產(chǎn)率均較為理想，且能夠滿足RAPD-PCR遺傳分析。本研究建立了一種簡便且高產(chǎn)率的微量山茶DNA提取方法，可簡化試驗(yàn)處理過程、降低實(shí)驗(yàn)成本、有效提高大批樣品的檢測(cè)效率。

［1］陳睿, 鮮小林, 秦帆, 等. 四川觀賞用山茶資源及景觀應(yīng)用研究［J］. 北方園藝, 2012, 11：97-101.

［2］李仲芳, 楊霞, 謝孔平, 等. 樂山茶花品種資源調(diào)查報(bào)告Ⅱ［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 43（9）：1357-1362.

［3］李仲芳, 楊霞, 高彥明. 樂山茶花品種資源調(diào)查報(bào)告［J］. 北方園藝, 2011（20）：86-89.

［4］胡歡, 楊述章, 李仲芳, 等. 30種茶花過氧化物酶同工酶分析［J］.四川師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, （2）：296-301.

［5］Umar KM, Mohammed AS, Radu S, et al. Extraction and isolation of PCR amplifiable genomic DNA from Camellia sinensis（L.）Kuntze［J］. Food, Agriculture and Environment, 2011, 9（3-4）：529-532.

［6］陳析豐, 查笑君, 范文杰, 等. 山茶花葉片DNA提取及RAPD反應(yīng)體系的研究［J］. 植物研究, 2007, 27（2）：219-220.

［7］魏群. 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］. 北京：高等教育出版社,

2007：113-114.

［8］田杰, 羅科. 水稻總DNA的快速制備［J］. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2004, 10（2）：143-145.

［9］吳波, 高丹, 潘超美, 等. 不同方法提取吳茱萸葉片基因組DNA和RNA的比較［J］. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 39（1）：111-115.

［10］戴劍, 洪德林, 張大棟, 等. 一種快速高效的DNA提取方法研究［J］. 麥類作物學(xué)報(bào), 2011, 31（3）：437-442.

［11］李娟, 江昌俊, 王朝霞. 中國茶樹初選核心種質(zhì)遺傳多樣性的RAPD分析［J］. 遺傳, 2005, 27（5）：765-771.

［12］Chen SX, Qi GN, Li H, et al. Rapid establishment of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCRRFLP）system for chloroplast DNA in tea［Camellia sinensis（L.）O. Kuntze］［J］. African Journal of Biotechnology, 2012, 11（33）：8181-8188.

［13］劉嬋, 王博, 段青, 等. 滇山茶基因組 DNA 不同提取方法效果比較［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 6：49-50.

［14］Yang CF, Chen BL, Huang CM, et al. Isolation of genomic DNA and establishment of ISSR reaction system for Camellia crepnelliana Tutch［J］. Journal of Southern Agriculture, 2011, 42（3）：233-235.

［15］Lin JK, KudrnaD, Rod AW. Preparation of high molecular weight（HMW）genomic DNA from tea plant（Camellia sinensis）for BAC library construction［J］. Journal of Agricultural Science and Technology, 2009, 3（1）：1-10.

［16］譚曉風(fēng), 漆龍霖, 黃曉光, 等. 山茶屬植物葉片DNA抽提［J］.中南林學(xué)院學(xué)報(bào), 1999（4）：75-77.

［17］倪穗, 田敏, 李紀(jì)元. 紅山茶高質(zhì)量基因組DNA的提取［J］.寧波大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 20：163-167.

［18］林立, 倪穗, 李紀(jì)元, 等. 中日5個(gè)島嶼山茶種群遺傳多樣性研究［J］. 廣西植物, 2012, 32（3）：298-303.

［19］周阿濤, 岳亮亮, 李旻, 等. 云南山茶（Camellia reticulata）nrDNA nrDNA ITS序列多態(tài)性分析［J］. 植物科學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 31（1）：1-10.

［20］駱文華, 黃仕訓(xùn), 馬虎生, 等. 廣西火桐基因組DNA提取方法的研究［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 52（20）：5060-5062.

［21］代文娟, 唐文秀, 鄧濤, 等. 狹葉坡壘基因組總DNA的提取和純化方法研究［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2011（7）：101-105.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Establishment of a DNA Extraction Method Suitable for RAPD Analysis of Trace Arnounts of Camellia japonica L.

Fan Jing1Li Zhongfang1，2Gao Minghui1Fu Qinchao1
（1. College of Life Science，Leshan Normal University，Leshan 614004；2. College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001）

To explore a simple and high yield method for preparing DNA suitable for RAPD analysis, trace fresh and dried leaves of Camellia japonica L. were used as materials. Moreover, the improved CTAB, SDS and Triton X-100 methods without using liquid nitrogen were compared. The efficiencies of different DNA extraction methods, the effects of material preservation and material amounts on DNA qualities were compared based on the absorbance spectrum and ratio of absorbance at 230 nm, 260 nm and 280 nm by Ultraviolet Spectrophotometry. Results showed that dried materials were more suitable for DNA extraction than fresh materials. The improved CTAB protocol for isolating DNA from dried leaf tissues gave satisfied results, with the ratio of A260/A280 ranged from 1.595 to 1.736. Furthermore, the DNA yield reached 230 to 295 μg per gram of leaf. Finally, clear amplified bands were detected by RAPD-PCR. High quality and high yield genomic DNA could be prepared from 100 mg dried leaves of Camellia japonica L., an increase in materials leads to the increased in DNA amount, however, impurity was also increased.

DNA extraction RAPD Camellia japonica L. Improved CTAB protocol

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.011

2014-06-174

樂山師范學(xué)院科研項(xiàng)目（Z1201），樂山師范學(xué)院峨眉山生物多樣性保護(hù)與利用研究所科研項(xiàng)目（12S01）

范晶，男，博士，副教授，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：fanjing972001@sohu.com