宋美艷，張永輝，樸元國，李春梅

南京農業(yè)大學動物科技學院，南京 210095

環(huán)境內分泌干擾物是一類通過干擾生物體內調節(jié)發(fā)育過程的天然激素的合成、分泌、運輸、結合、反應和代謝等過程，從而對生物體的生殖、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等的功能產(chǎn)生影響的外源性化學物質。4-硝基酚(4-nitrophenol，PNP)是一種重要的化工原料，廣泛應用于生產(chǎn)殺蟲劑、除草劑、染料、醫(yī)藥等行業(yè)，常常在生產(chǎn)和使用過程中被釋放到環(huán)境中，它們難以降解，在環(huán)境中可長期殘留，對土壤、水體和大氣造成嚴重的污染[1-3]，已被美國環(huán)境保護局和我國列為“優(yōu)先控制污染物”之一。最近研究發(fā)現(xiàn)柴油車尾氣[4-5]和酸雨[6]中也含有PNP，而且PNP是對硫磷、甲基對硫磷、馬拉硫磷等有機磷農藥的水解產(chǎn)物[7]。環(huán)境中各種來源的PNP嚴重威脅著人類及動物的健康。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)PNP具有雌激素和抗雄激素樣作用[8]，能夠引起睪丸激素分泌紊亂[9-10]，擾亂雄性大鼠腎上腺皮質類固醇激素的分泌[11]。肝臟是外來化學物質代謝的主要靶器官，PNP在動物體內最終通過葡萄糖醛酸鹽形式或硫酸鹽形式排出[12-13]，其在代謝過程中是否對大鼠肝臟造成影響尚未見報道。

核因子相關因子-2(Nrf2)通路是近年來發(fā)現(xiàn)的化學應激的防御性轉導通路，正常情況下，Nrf2和細胞骨架相關蛋白Keap1結合在一起，當機體受到外來化學物質刺激時，兩者分離，Nrf2轉移入核與抗氧化反應元件ARE結合，啟動Nrf2下游靶基因醌氧化還原酶(NQO1)、血紅素加氧酶(HO-1)以及谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)等的表達。我們通過預實驗發(fā)現(xiàn)PNP能夠引起大鼠肝臟氧化應激，而Nrf2信號通路是抗氧化應激的主要通路之一，因此本試驗通過對大鼠皮下注射不同劑量的PNP，探討PNP對大鼠肝臟功能及Nrf2信號轉導通路的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料和試劑

1.1.1 主要試劑及儀器

4-硝基酚(4-nitrophenol，PNP，純度99.9%，成都科隆化學品有限公司)，多聚甲醛(上海凌峰化學試劑有限公司)，動物切片石蠟(熔點60～62 ℃，上海國藥集團化學試劑有限公司)，抗氧化和肝功能測試盒(南京建成生物工程研究所)，HE(蘇木精-伊紅)染液(南京建成生物科技有限公司)，反轉錄試劑盒和PCR定量試劑盒(上海皓嘉科技發(fā)展有限公司)。

石蠟切片機Leica RM2235和烘片機Leica HI1220(上海徠卡儀器有限公司)，光學顯微鏡Nikon YS100(日本Nikon株式會社)，酶標儀(美國Thermo公司)，5417R型臺式冷凍高速離心機(德國Eppendorf公司)，低溫冷凍離心機J2-MI型(德國Beckman公司)，Real-time PCR儀(美國Bio-rad公司)。

1.1.2 試驗動物和樣品采集

選取20只21日齡SD雄性大鼠(購自南京青龍山實驗動物研究所)，飼養(yǎng)在人工控制的環(huán)境中，12 h光照(07:00 至 19:00)和12 h黑暗，溫度(23±2 ℃)，濕度(50%±10%)，自由采食和飲水。隨機分為4組，每組5只，各組間體重無顯著性差異(p>0.05)。溶劑是含0.05% Tween 80的PBS，PNP溶解于溶劑中。預飼一周后，分別皮下注射溶劑1、10和100 mg·kg-1體重的PNP，每天早晨9點注射一次，連續(xù)注射28 d。最后一次注射24 h后，大鼠頸動脈采血及采集肝臟樣品。采集的部分肝臟固定于4 %多聚甲醛，用于HE染色；部分樣品用2.5 %戊二醛緩沖液固定，用于透射電鏡觀察；再取一小部分保存于-80 ℃，用于RNA檢測；剩余肝臟保存于-20 ℃，用于生化指標測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 血清肝功能指標檢測

頸動脈采血后，3 500 r·min-1離心15 min，吸取上清液，采用試劑盒測定谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)的活性和總膽紅素(TBIL)的含量。

1.2.2 肝臟組織抗氧化指標檢測

稱取肝臟組織0.1～0.15 g，按重量體積比加入9倍體積的冰冷生理鹽水，用組織勻漿機10 000～15 000 r·min-1充分研磨，然后3 800 r·min-1離心15 min，吸取上清液備用。采用試劑盒測定過氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的含量和過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的活性。

1.2.3 肝臟組織結構觀察

對照組和處理組大鼠肝臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋處理，切片，HE染色，觀察肝臟顯微結構變化。取對照組和100 mg·kg-1PNP組大鼠的部分肝臟，固定于2.5%磷酸戊二醛溶液，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，鋨酸染色，在透射電鏡下觀察肝細胞超微結構的變化并記錄。

1.2.4 肝臟組織總RNA的提取和定量測定

按照Trizol說明書提取肝臟組織的總RNA，提取的RNA保存于-70 ℃超低溫冰箱中，或立即用于反轉錄。反轉錄時，按照Takara Prime Script ? RT reagent Kit反轉錄試劑盒說明書，取上述純化的總RNA 2.0 μg 加入2×RT Buffer 10 μL、20×RT Enzyme Mix 1 μL、Nuclease-free H2O補足至20 μL，置于PCR儀內37 ℃ 15 min，95 ℃反轉錄滅活15 s，反應結束后所得cDNA用于定量PCR。按照Takara SYBR?Premix Ex TaqTM定量試劑盒說明書，依次往定量PCR管加入下列試劑(20 μL體系)：H2O 6.8 μL、引物(10 μmol·L-1各0.4 μL、模板2 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、SYBR Premix Ex Taq 10 μL，混勻離心后在Real-time PCR儀上反應檢測，反應程序如下： 95 ℃變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，重復45個循環(huán)；反應結束繪制熔解曲線。利用2-△△Ct法對基因表達進行相對定量，下表為試驗中所用引物序列，見表1。

表1 Real-time PCR所用引物Table 1 Primers for Real-time PCR analyses

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

各組數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標準誤(Mean ± SEM)表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)，Dunnett 法進行差異性比較，p< 0.05為差異顯著，p< 0.01為差異極顯著，p< 0.001為差異極顯著。以上數(shù)據(jù)分析均采用GraphPad Prism 5 軟件完成。

2 結果(Results)

2.1 4-硝基酚對大鼠體重和肝臟重量的影響

對照組和PNP處理組大鼠生長正常，體重、肝臟的絕對重量和相對重量均無顯著性差異(p> 0.05)，PNP處理組大鼠的體重與對照組相比，略有下降趨勢，但差異不顯著(p> 0.05)，見表2。

2.2 4-硝基酚對大鼠血清肝功能的影響

與對照組相比，血清中ALT、AST、AKP活性和TBIL含量在100 mg·kg-1組均顯著性升高(p< 0.05)；1 mg·kg-1組AST和AKP活性顯著性升高(p< 0.05)；10 mg·kg-1組AKP的活性顯著性升高(p< 0.05)，見表3。

2.3 4-硝基酚對大鼠肝臟組織結構的影響

圖1為各組大鼠肝臟的顯微結構變化，從中可以看到，對照組肝細胞排列緊密，形態(tài)正常(圖1A)。

表2 PNP對大鼠體重、肝臟重及肝臟系數(shù)的影響Table 2 Effects of PNP on the body weight, liver weight and liver index of rats

注：數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準誤(Mean±SEM)表示，n=5

Note：Values are expressed as Mean ± SEM，n=5

表3 PNP對大鼠血清中肝功能標志物的影響Table 3 Effects of PNP on the indicators of liver function in serum of rats

注：數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準誤(Mean±SEM)表示，n=5。與對照組相比，*p<0.05。

Note: Values are expressed as Mean ± SEM for 5 animals. Compared with control group, *p< 0.05.

與對照組相比，1 mg·kg-1PNP組肝細胞核著色較深，匯管區(qū)有大量淋巴細胞浸潤(圖1B)；10 mg·kg-1PNP組肝臟匯管區(qū)有大量淋巴細胞浸潤(圖1C)；100 mg·kg-1PNP組中央靜脈有大量淋巴細胞浸潤，肝血竇變寬(圖1D)。

圖2為對照組和100 mg·kg-1PNP組大鼠肝臟的超微結構圖。從中可以看到，對照組肝細胞核呈圓形，細胞核周圍有大量的線粒體和內質網(wǎng)，線粒體完整，內質網(wǎng)排列整齊(圖2A)。與對照組相比，100 mg·kg-1PNP組肝細胞核發(fā)生固縮(圖2B)、內質網(wǎng)排列紊亂(圖2C)、出現(xiàn)凋亡小體(圖2D)、線粒體部分內外膜消失和線粒體嵴斷裂(圖2E)。

圖1 PNP處理對大鼠肝臟顯微結構的影響(A)對照組；(B)1 mg·kg-1 PNP組；(C)10 mg·kg-1 PNP組；(D)100 mg·kg-1 PNP組Fig. 1 Effects of PNP on microstructure change in rat liver (A) Control group；(B) 1 mg·kg-1 PNP group；(C) 10 mg·kg-1 PNP group；(D) 100 mg·kg-1 PNP group

圖2 PNP處理對大鼠肝臟超微結構的影響(A)對照組；(B)、(C)、(D)、(E)100 mg·kg-1 PNP組Fig. 2 Effects of PNP on ultrastructure change in rat liver (A) Control group；(B、C、D、E) 100 mg·kg-1 PNP group

2.4 4-硝基酚對大鼠肝臟氧化和抗氧化系統(tǒng)的影響

與對照組相比：H2O2和MDA含量均在1 mg·kg-1組顯著性升高(p< 0.01，p< 0.05，見圖3A、3B)；10 mg·kg-1和100 mg·kg-1組CAT活性均顯著性降低(p< 0.01，p< 0.001，見圖3C)；1、10和100 mg·kg-1組SOD活性均顯著低于對照組(p< 0.001，見圖3D)；10和100 mg·kg-1組GSH含量(p< 0.01，p< 0.001，見圖3E)及GSH-PX活性(p< 0.01，p< 0.05，見圖3F)均顯著性降低。

圖3 PNP處理對大鼠肝臟氧化和抗氧化系統(tǒng)的影響 (A)H2O2，(B)MDA，(C)CAT，(D)SOD，(E)GSH，(F)GSH-PX 注：數(shù)值用Mean±SEM表示，n=5，與對照組相比，* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001Fig. 3 Effects of PNP on oxidation and antioxidant system in rat liver (A) H2O2，(B) MDA，(C) CAT，(D) SOD，(E) GSH，(F) GSH-PXNote：Values are expressed by the Mean ± SEM of 5 rats per group．* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001

2.5 4-硝基酚對大鼠肝臟Nrf2相關基因表達的影響

圖4為各組大鼠肝臟的Nrf2、HO-1、NQO1和GCLC mRNA相對表達量的變化。與對照組相比，1 mg·kg-1組的Nrf2(圖4A)、HO-1(圖4B)和NQO1(圖4C)顯著性升高(p< 0.05)，GCLC(圖4D)有升高趨勢(p> 0.05)；Nrf2、HO-1和NQO1在100 mg·kg-1組有升高趨勢，但差異不顯著(p> 0.05)。

3 討論(Discussion)

3.1 4-硝基酚對大鼠體重和肝臟重量的影響

臟器系數(shù)一般適用于檢測心、肝、脾、肺和腎等實質性器官，如果臟器系數(shù)變小，表明臟器可能出現(xiàn)萎縮和退行性變化；如果臟器系數(shù)變大，表明臟器可能出現(xiàn)水腫、充血和增生等病變[14]。本試驗PNP處理沒有引起大鼠體重、肝臟重和肝臟系數(shù)發(fā)生顯著性變化，說明PNP在本實驗劑量下對大鼠生長沒有顯著性影響。

3.2 4-硝基酚對大鼠血清肝功能的影響

肝臟是動物體物質代謝活動的中心，含有大量酶類。肝臟酶的釋放是反應肝細胞損傷的重要指標。外源化學物質能以肝臟為主要靶器官，促使肝細胞損傷，導致肝臟分泌到血清中的酶類發(fā)生變化。本試驗結果顯示，100 mg·kg-1PNP處理組的大鼠血清ALT和AST活性以及TBIL含量顯著性升高，10 mg·kg-1PNP組AKP活性顯著性升高，1 mg·kg-1PNP組大鼠血清AST活性顯著性升高，這一結果與柳成剛等[15]研究的二甲基亞硝胺對大鼠肝損傷的結果一致。我們的研究結果說明皮下注射PNP能夠引起肝臟的功能損傷。

圖4 PNP處理對大鼠肝臟Nrf2及其相關基因的mRNA相對表達量的影響(A)Nrf2 mRNA，(B)HO-1 mRNA，(C)NQO1 mRNA，(D)GCLC mRNA注：數(shù)值用Mean±SEM表示，n=5，與對照組相比，* p < 0.05Fig. 4 Effects of PNP on the mRNA expression`levels of Nrf2 and related genes in rat liver (A) Nrf2 mRNA，(B) HO-1 mRNA，(C) NQO1 mRNA，(D) GCLC mRNANote：Values are expressed by the Mean±SEM of 5 rats per group, * p < 0.05.

3.3 4-硝基酚對大鼠肝臟的氧化損傷

動物機體存在兩類抗氧化防御體系，一類是酶促抗氧化系統(tǒng)，包括CAT、SOD、GSH-Px等；另一類是非酶促抗氧化系統(tǒng)，包括谷胱甘肽、維生素E、類胡蘿卜素、微量元素銅、硒等[16]。當外源化學物質進入機體后，會導致機體內自由基和氧化產(chǎn)物增多，使體內的氧化與抗氧化失去平衡，出現(xiàn)生理不適現(xiàn)象。MDA是細胞膜脂質過氧化產(chǎn)物，在抗氧化酶活性降低的情況下，MDA和H2O2含量應該是升高的。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，1 mg·kg-1PNP處理組大鼠MDA和H2O2含量顯著性升高，但10 mg·kg-1和100 mg·kg-1PNP處理組大鼠的肝臟中GSH含量和CAT、SOD活性均顯著性降低，MDA和H2O2含量均沒有顯著性變化。這可能是由于以下原因：第一，機體的酶系防御系統(tǒng)受到破壞時，非酶系統(tǒng)發(fā)揮作用，短時間內并不會造成組織細胞膜損傷；第二，多羥基酚性成分具有捕捉自由基的功能，較高劑量PNP可能通過捕捉細胞內自由基，避免引起細胞膜脂質過氧化損傷，從而降低脂質過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生[17]。

3.4 4-硝基酚對大鼠肝臟Nrf2相關基因表達的影響

近年研究發(fā)現(xiàn)，在應激條件下，如血紅素、H2O2、重金屬和內毒素等，均可通過Nrf2 啟動HO-1 的表達表現(xiàn)出明顯的抗氧化作用[18-19]。李梅等[20]研究發(fā)現(xiàn)順鉑能顯著誘導腎臟中Nrf2 核轉位, 其下游Ⅱ相解毒酶基因NQO1、GCLC和HO-1 mRNA 表達水平也顯著增加。本試驗也發(fā)現(xiàn)1 mg·kg-1PNP處理使大鼠肝臟Nrf2 mRNA表達升高，HO-1和NQO1 mRNA表達水平也升高，變化趨勢基本一致。試驗結果表明，大鼠在應激條件下可能通過啟動Nrf2信號通路來抵抗PNP引起的肝臟氧化損傷。但本試驗中10 mg·kg-1和100 mg·kg-1PNP處理組大鼠Nrf2相關基因的表達均沒有顯著性變化，原因可能是較高劑量PNP引起肝臟毒性，激活了肝臟的其它通路，這還有待進一步研究。

綜上所述，皮下注射1 mg·kg-1PNP引起了大鼠肝臟氧化損傷，機體通過提高Nrf2及其相關基因mRNA的表達水平來抵抗PNP引起的肝臟損傷。100 mg·kg-1PNP組大鼠肝臟的顯微和超微結構有較嚴重損傷，肝臟抗氧化酶活性顯著低于對照組，然而Nrf2通路相關基因的mRNA表達水平卻沒有顯著性升高。由此我們推測，100 mg·kg-1PNP改變了肝臟的正常生理功能，造成肝細胞超微結構病理損傷，導致肝臟毒性。

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