宋志慧，劉 冰

青島科技大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，山東青島 266042

我國作為一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥被大量大范圍使用，農(nóng)藥的污染時(shí)時(shí)刻刻影響著水生態(tài)系統(tǒng)。在過去的幾十年中，有機(jī)磷農(nóng)藥已經(jīng)在農(nóng)業(yè)和家庭應(yīng)用中取代有機(jī)氯農(nóng)藥，并被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和公共衛(wèi)生，包括殺蟲劑，殺線蟲劑，殺螨劑，和殺菌劑。基本上都被用作殺蟲劑和神經(jīng)毒劑。自從有機(jī)磷農(nóng)藥被人們認(rèn)識(shí)，有機(jī)磷的公眾暴露水平，職業(yè)和非職業(yè)性，急性或慢性也引起人們的關(guān)注，并且已經(jīng)嚴(yán)重影響了人類的健康[1]。如今，各式各樣的具有多種生物學(xué)特性的有機(jī)磷農(nóng)藥的廣泛使用使得在全世界，特別是在發(fā)展中國家，有機(jī)磷中毒已經(jīng)成為發(fā)病率和死亡率的一個(gè)主要原因[2]。目前國內(nèi)外已有大量關(guān)于有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)人類健康、無脊椎動(dòng)物、魚類、浮游植物的影響及其毒理學(xué)研究的報(bào)道[3-12]，Gama-Flores等[10]研究了農(nóng)藥甲基對(duì)硫磷在不同食物密度(小球藻)條件下對(duì)角突臂尾輪蟲的急性和慢性毒性，研究表明在小球藻密度為(0.75×106) cells·mL-1時(shí)，甲基對(duì)硫磷對(duì)角突臂尾輪蟲的24 h-LC50為(2.783±0.316) mg·L-1，在小球藻密度為(3×106) cells·mL-1時(shí)，甲基對(duì)硫磷對(duì)角突臂尾輪蟲的24 h-LC50為(6.52±0.77) mg·L-1。

世界衛(wèi)生組織建議對(duì)農(nóng)藥的分類，認(rèn)為氧化樂果為高度危險(xiǎn)(Ib類)，對(duì)大鼠的LD50為50 mg·kg-1體重。目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)于氧化樂果的研究主要集中在氧化樂果的檢測(cè)方法[13～16]、殘留分析[17～18]、毒性研究[19-22]等方面。氧化樂果作為一種廣泛使用的有機(jī)磷農(nóng)藥，由于它主要作用于乙酰膽堿酯酶，抑制動(dòng)物的神經(jīng)傳導(dǎo)，對(duì)它的毒性研究也主要集中在對(duì)動(dòng)物的研究。楊帆，鄒容[19]發(fā)現(xiàn)氧化樂果對(duì)黃顙魚幼魚在靜態(tài)條件下的安全濃度分別為16.94 μg·L-1，而在半靜態(tài)條件下的安全濃度為15.78 μg·L-1；E1-Banhawy[20]發(fā)現(xiàn)氧化樂果對(duì)巴西一種捕食性螨蟲的 LC50為1.2 mg·kg-1。這些毒理學(xué)研究在一定程度上為環(huán)境監(jiān)測(cè)提供了依據(jù)，但在農(nóng)藥對(duì)水環(huán)境的污染越來越嚴(yán)重的今天，隨著對(duì)有毒物質(zhì)的生態(tài)效應(yīng)的研究由單一物種向生態(tài)系統(tǒng)整體效應(yīng)的更大關(guān)注，農(nóng)藥對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者——藻類的毒性及其生態(tài)毒理學(xué)研究也已經(jīng)引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。

藻類作為水生生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，能通過光合作用，為無脊椎動(dòng)物、魚類、水鳥等生物提供O2、食物，其種類多樣性和初級(jí)生產(chǎn)量直接影響水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。目前國內(nèi)外關(guān)于農(nóng)藥對(duì)藻類的毒性研究已有一些報(bào)道，但大多數(shù)是研究除草劑[23～27]、重金屬[28～29]對(duì)于藻類的毒性研究，Andrzej等[28]研究發(fā)現(xiàn)重金屬抑制小球藻生長的作用順序?yàn)椋恒~>鉛>鎘；Qian等人[24]研究了除草劑草丁瞵(glufosinate)、阿特拉津(atrazine)和禾草靈(diclofop-methyl)對(duì)小球藻基因轉(zhuǎn)錄的影響，他們發(fā)現(xiàn)這3種供試藥物對(duì)小球藻光合作用基因psbC和rbcL相對(duì)表達(dá)量有顯著地抑制作用。

目前關(guān)于氧化樂果對(duì)藻類的毒理學(xué)研究還較少，而且我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)對(duì)藻類的毒理學(xué)研究集中在抗氧化酶系統(tǒng)的研究，對(duì)硝酸還原酶系統(tǒng)的影響卻鮮有報(bào)道，因此本文研究了氧化樂果對(duì)小球藻的毒性研究，通過對(duì)硝酸還原酶活性、葉綠素含量的研究，為陸地上農(nóng)藥合理使用提供決策依據(jù)，同時(shí)也了解了氧化樂果對(duì)小球藻的毒害作用。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：722型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，GXZ型智能培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)，LDZ4-0.8A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

試劑：磺胺等化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

40%氧化樂果乳油，購于山東大成農(nóng)藥廠。

小球藻，由中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院提供。

試驗(yàn)用培養(yǎng)基及所有器皿均經(jīng)過121 ℃高壓滅菌15 min，采用BG-11培養(yǎng)基，藻種在無菌條件下置于250 mL錐瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)液100 mL，溫度25±2 ℃，光暗比14:10，光強(qiáng)4 000 Lux，每天振搖4次，每次15 min。培養(yǎng)3代，待鏡檢細(xì)胞正常，選擇對(duì)數(shù)生長期的藻液進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將達(dá)到對(duì)數(shù)生長期的小球藻5 mL接種于100 mL的HB4培養(yǎng)液中，每個(gè)瓶中加入準(zhǔn)備好的氧化樂果母液，使其成系列濃度，并設(shè)置一個(gè)對(duì)照組(0 mg·L-1)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行。靜止培養(yǎng)，每天定時(shí)人工搖動(dòng)3次，每隔24 h取樣，取樣前充分搖勻藻液。

1.4 預(yù)實(shí)驗(yàn)

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)確定的毒性范圍配置一系列濃度梯度的染毒液(0.1、1、10、20、30、40、50 mg·L-1)，在上述培養(yǎng)條件下隔天測(cè)定藻液在660 nm處吸光度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化樂果對(duì)小球藻的96 h-EC0和96 h-EC100分別為為0.5 mg·L-1、30 mg·L-1。

1.5 氧化樂果對(duì)小球藻的急性毒性試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)系列染毒濃度(1、5、10、15、20 mg·L-1)，并設(shè)置一個(gè)對(duì)照組(0 mg·L-1)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行。在上述測(cè)定條件下進(jìn)行各個(gè)指標(biāo)的測(cè)定。

1.5.1 氧化樂果對(duì)小球藻的EC50的測(cè)定

據(jù)實(shí)驗(yàn)所設(shè)濃度用分光光度計(jì)在660 nm處測(cè)其初始吸光度，以后每隔天測(cè)一次吸光度。通過將氧化樂果濃度的對(duì)數(shù)(lnC)為橫坐標(biāo)，抑制百分率的概率單位為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，用概率單位法得到氧化樂果對(duì)小球藻的EC50。

1.5.2 硝酸還原酶活性的測(cè)定

以μg NaNO2·L-1·Abs作為酶活單位。NaNO2的濃度可根據(jù)亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。

1.5.3 葉綠素含量的測(cè)定

培養(yǎng)條件不變的前提下，隔天取實(shí)驗(yàn)組和空白組5 mL藻液置于離心管中，3 000 r·min-1力離心10 min，棄去上清液，加入5 mL蒸餾水洗滌，3 000 r·min-1力離心10 min，棄去上清液，將沉淀懸浮于5 mL無水乙醇中將提取液放入冷藏室，提取24 h，然后將提取液在3 000 r·min-1力離心10 min，在645 nm和663 nm處測(cè)上清液的吸光度。

葉綠素(a + b)含量的計(jì)算[31]:

Ca+b=20.2A645+8.02A663

1.5.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均用平均值表示，用Origin 8.0對(duì)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行制圖，采用SPSS 19.0在p=0.05的置信水平對(duì)硝酸還原酶活性、葉綠素含量的變化情況進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 氧化樂果對(duì)小球藻生物量的影響

由圖1可以看出濃度小于1 mg·L-1時(shí)，前6 d小球藻生物量與對(duì)照組相比無明顯變化，隨時(shí)間增加到第6天時(shí)實(shí)驗(yàn)組小球藻生物量出現(xiàn)明顯降低，說明低濃度氧化樂果短時(shí)間內(nèi)對(duì)小球藻的細(xì)胞生長沒有影響；氧化樂果濃度大于5 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞的生長從第二天起就受到較強(qiáng)的抑制，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生物量明顯小于對(duì)照組，說明高濃度氧化樂果在作用初期就抑制了小球藻的細(xì)胞生長，而且氧化樂果濃度越高，抑制作用表現(xiàn)越明顯，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在第6天之后，小球藻生物量出現(xiàn)一定的補(bǔ)償增長。同時(shí)由圖2可以看出實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第8天時(shí)，總體來說隨著受試氧化樂果濃度的增加，小球藻的生物量在降低，氧化樂果濃度和小球藻的生物量的相關(guān)性方程為y=0.319-0.0455x，由此可知氧化樂果濃度和小球藻的生物量之間呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2為0.65755。同時(shí)由表2還可以看出各處理組之間以及對(duì)照組和處理組之間均存在顯著性差異(p<0.05)。

2.2 氧化樂果對(duì)小球藻EC50的影響

氧化樂果對(duì)小球藻的概率單位—濃度對(duì)數(shù)曲線方程和EC50如表1所示。從表1看出，氧化樂果對(duì)小球藻的EC50值隨時(shí)間增加處于下降狀態(tài)。

圖1 氧化樂果對(duì)小球藻生長量的影響(660 nm)Fig. 1 Toxic effects of omethoate on the biomass of Chlorella vulgaris (660 nm)

圖2 氧化樂果對(duì)小球藻生長量的影響(8 d)Fig. 2 Toxic effects of omethoate on the biomass of Chlorella vulgaris (8 d)

表1 氧化樂果對(duì)小球藻概率單位—濃度對(duì)數(shù)曲線方程和EC50Table 1 Regression curve of probit-concentration logarithm and EC50 of omethoate to Chlorella vulgaris

2.3 氧化樂果對(duì)小球藻硝酸還原酶活性的影響

由圖3可知，1、15、20 mg·L-1處理組之間相比較無顯著差異(p>0.05)，1、15、20 mg·L-1處理組與1、10 mg·L-1處理組和對(duì)照組之間相比均存在顯著差異(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第8天時(shí)，氧化樂果濃度在0～5 mg·L-1范圍內(nèi)，隨著氧化樂果濃度的升高，相比于對(duì)照組增加了12.7%，小球藻硝酸還原酶活性逐漸上升；當(dāng)?shù)竭_(dá)5 mg·L-1時(shí)，硝酸還原酶活性開始下降，隨著氧化樂果濃度的升高，小球藻硝酸還原酶活性逐漸降低，但仍高于對(duì)照組。

2.4 氧化樂果對(duì)小球藻葉綠素含量的影響

由圖4可知，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第6天時(shí)，氧化樂果對(duì)葉綠素b含量的影響實(shí)驗(yàn)中，5 mg·L-1處理組與1 mg·L-1和對(duì)照組之間無顯著性差異(p>0.05)，其余各濃度組之間、各濃度組與對(duì)照組之間均存在顯著差異(p<0.05)，并且隨氧化樂果濃度的增加，小球藻體內(nèi)葉綠素的含量整體呈下降趨勢(shì)，而且空白組藻體內(nèi)的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量都明顯高于濃度組。

圖3 氧化樂果對(duì)小球藻硝酸還原酶活性的影響Fig. 3 Toxic effects of omethoateo on nitrate reductase activity of Chlorella vulgaris

圖4 氧化樂果對(duì)葉綠素含量的影響(6 d)Fig. 4 Toxic effects of omethoate on chlorophyll content of Chlorella vulgaris(6 d)

3 討論(Discussion)

方漢孫等[32]人研究發(fā)現(xiàn)，在0.001、0.01、0.1 mg·L-1敵敵畏3個(gè)質(zhì)量濃度處理下，赤潮異彎藻第3～5 d的相對(duì)增長率顯著高于對(duì)照組，在1、10 mg·L-1質(zhì)量濃度處理下，最初微藻增長受抑制，在培養(yǎng)7 d之后出現(xiàn)一定補(bǔ)償增長現(xiàn)象。由圖1我們看出低濃度氧化樂果(1 mg·L-1)在前6 d對(duì)小球藻細(xì)胞增長影響不大，高濃度(大于5 mg·L-1)則在初期就表現(xiàn)為抑制，氧化樂果濃度與細(xì)胞數(shù)量之間表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)(R2=0.65755)，如方漢孫的研究結(jié)果一致，而且在后期也出現(xiàn)一定的補(bǔ)償增長現(xiàn)象。

裴國鳳等[33]研究發(fā)現(xiàn)，以生物量計(jì)，三聚氰胺抑制近頭狀偽蹄形藻和斜生柵藻生長的72 h-EC50值分別是537.67 mg·L-1和485.17 mg·L-1，為較低的毒性效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中氧化樂果對(duì)小球藻96 h-EC50值為4.88 mg·L-1，屬于中毒，同時(shí)由表1可以看出，隨著受試氧化樂果濃度的增加，EC50值呈降低趨勢(shì)，可能是由于隨毒物作用時(shí)間的延長，藻細(xì)胞分裂速度減慢，死亡速度增加，導(dǎo)致細(xì)胞密度下降EC50值降低。也可能是由于培養(yǎng)時(shí)間的延長，而在此期間又不添加營養(yǎng)物，導(dǎo)致營養(yǎng)的缺乏或其它理化條件的改變，進(jìn)而藻細(xì)胞數(shù)減少，EC50下降。

葉綠素的含量水平是植物生長能力大小的直接表現(xiàn)。當(dāng)一定濃度的有機(jī)磷作用于小球藻，會(huì)使細(xì)胞生理活性降低，從而降低細(xì)胞對(duì)微量元素的吸收作用，尤其是鐵、鎂等元素的吸收量大大降低，這就進(jìn)一步導(dǎo)致了小球藻體內(nèi)葉綠素含量的降低。方漢孫等[32]同時(shí)發(fā)現(xiàn)低濃度敵敵畏對(duì)赤潮異彎藻葉綠素a的影響表現(xiàn)為促進(jìn)作用，高濃度則表現(xiàn)為抑制；岳文潔等[37]也通過對(duì)氯氰菊酯對(duì)海洋卡盾藻Chl.a含量的影響的研究發(fā)現(xiàn)，低濃度氯氰菊酯對(duì)海洋卡盾藻葉綠素a的影響表現(xiàn)為促進(jìn)作用，高濃度則表現(xiàn)為抑制，這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果大體一致。圖4反映出當(dāng)氧化樂果濃度高于1 mg·L-1時(shí)，隨氧化樂果濃度的增加葉綠素含量下降，可能是小球藻葉綠素含量對(duì)氧化樂果反應(yīng)比較靈敏，則總體表現(xiàn)為抑制作用。

硝酸還原酶活性和葉綠素含量分別體現(xiàn)了氮代謝水平的速率和光合作用的大小。這兩個(gè)指標(biāo)對(duì)于藻細(xì)胞的生長都起到關(guān)鍵作用，因此對(duì)這兩個(gè)指標(biāo)的研究具有一定的代表性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以認(rèn)為氧化樂果對(duì)小球藻生長的影響是通過抑制葉綠素的形成，進(jìn)而抑制光和作用來實(shí)現(xiàn)的，這與劉青等[38]人的研究結(jié)果一致，且與硝酸還原酶活性相比，葉綠素的含量能更靈敏的反映這種損傷，故而葉綠素含量能夠作為一種有效的生物標(biāo)志物對(duì)氧化樂果引起的毒性做出評(píng)價(jià)。而且目前對(duì)于藻類的毒理學(xué)研究很多，其研究指標(biāo)不止包括葉綠素含量、硝酸還原酶活性，還包括各種抗氧化酶活性[39]、葉綠素?zé)晒馓卣鱗40]等指標(biāo)，因此，關(guān)于氧化樂果對(duì)小球藻細(xì)胞的毒理學(xué)研究的具體機(jī)理還需進(jìn)一步探究。

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