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(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

乳糖酸(LactobionicAcid)是集修護、抗老、保濕、抗氧化、促進肌膚更新[1-2]于一身的新型多羥基有機酸[3]。乳糖酸本身即存在于人體中,因其具有良好的吸濕性、抗氧化性、金屬螯合性以及溫和的酸感,被廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)、食品制造業(yè)、醫(yī)藥業(yè)和精細化工行業(yè)中作為皮膚保養(yǎng)品[2]、食品添加劑、Wisconsin移植液[4]、增強紅霉素及克拉霉素等抗生素的溶解性[5]和生物降解成分等。

迄今為止,乳糖酸的生產(chǎn)方法主要有化學催化法[6-8]、酶法[9-11]和生物轉(zhuǎn)化法[12-13],但化學催化法伴有多種副產(chǎn)物產(chǎn)生,酶法的生產(chǎn)成本較高,都限制了乳糖酸的工業(yè)產(chǎn)量和市場占有率。每年約有290萬t廢棄乳糖排放到環(huán)境中,利用微生物將過剩乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸,可以變廢為寶,增加附加值,并大大減少環(huán)境壓力,造福于民[14-15]。

本文應(yīng)用Plackett-Burman實驗設(shè)計系統(tǒng)考察了影響土生拉烏爾菌RsoultellaterrigenaY20生產(chǎn)乳糖酸的培養(yǎng)基成分,發(fā)現(xiàn)該菌是耐高濃度乳糖的菌株且具有高產(chǎn)潛力,這對于進一步推動乳糖酸的產(chǎn)業(yè)化是有利的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土生拉烏爾菌Y20(RsoultellaterrigenaY20) 由沈陽農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室分離并保存;斜面培養(yǎng)基(%):乳糖1.0,NH4NO30.2,NaCl 0.05,K2HPO40.1,KH2PO40.1,MgSO40.05,瓊脂1.5,pH7.2～7.4;種子培養(yǎng)基(%):乳糖10.0,蛋白胨1.0,NaCl 0.05,K2HPO40.1,KH2PO40.1,MgSO40.05,pH 7.2～7.4。液體發(fā)酵培養(yǎng)基(%):乳糖12.0,蛋白胨1.0,NaCl 0.05,K2HPO40.1,KH2PO40.1,MgSO40.05,pH7.2～7.4。乳糖 沈陽市東興試劑廠;硝酸銨 沈陽化學試劑廠;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、NaOH 沈陽化學試劑廠;乳糖酸 Sigma公司;NaCl 沈陽沈一精細化學品有限公司;蛋白胨、酵母膏 北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司;瓊脂 Sanland Chemical Co,LTD;乙腈、檸檬酸、磷酸氫二鈉 天津市大茂化學試劑廠。

AIR TECH超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司;LZDX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;HG303-4A電熱恒溫培養(yǎng)箱 南京實驗儀器廠;DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;JD200-3型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;Waters2487高效液相色譜儀 美國waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng):250mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基50mL,115℃滅菌20min,接種搖瓶培養(yǎng),搖床轉(zhuǎn)速180r/min,溫度30℃,培養(yǎng)12h。

搖瓶發(fā)酵:250mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基50mL,種子液以2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)速180r/min,溫度30℃,培養(yǎng)48h。

1.2.2 乳糖酸含量的測定 用高效液相色譜法對乳糖酸生產(chǎn)菌株RsoultellaterrigenaY20的產(chǎn)乳糖酸能力進行定量測定,以NH2P-50為色譜柱,CH3CN和40mmol/L Na2HPO4-20mmol/L檸檬酸緩沖液為流動相,在pH5.0的條件下,以6∶4的比率,0.8mL/min的流速,在40℃下以低比率泵進,進樣量為10μL,用示差檢測器檢測。

1.2.3 單因素實驗設(shè)計

1.2.3.1 氮源種類對乳糖酸產(chǎn)量的影響 在溫度為28℃,乳糖含量為120g/L,Mg2+濃度為0.5g/L,Na+濃度為0.5g/L,pH7.2的條件下,分別以硝酸銨、硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏和尿素為氮源,含量均為10g/L,恒溫培養(yǎng)2d,以氮源種類為橫坐標,乳糖酸產(chǎn)量為縱坐標,重復(fù)3次,確定Y20的最佳氮源種類。

1.2.3.2 氮源含量對乳糖酸產(chǎn)量的影響 在溫度為28℃,乳糖含量為120g/L,Mg2+濃度為0.5g/L,pH為7.2的條件下,蛋白胨含量分別為5、10、15、20、25g/L,硝酸銨含量分別為1、2、3、4、5g/L時,恒溫培養(yǎng)2d,以氮源含量為橫坐標,乳糖酸產(chǎn)量為縱坐標,重復(fù)3次,確定Y20的最適氮源含量。

1.2.3.3 碳源含量對乳糖酸產(chǎn)量的影響 其他條件不變,碳源(即乳糖)含量分別為20、40、60、80、100、120、140g/L時,恒溫培養(yǎng)2d,以碳源含量為橫坐標,乳糖酸產(chǎn)量為縱坐標,重復(fù)3次,確定Y20的最適碳源含量。

1.2.3.4 pH對乳糖酸產(chǎn)量的影響 其他條件不變,pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0時,考察其對乳糖酸產(chǎn)量的影響。

1.2.3.5 無機鹽離子對乳糖酸產(chǎn)量的影響 其他條件不變,Mg2+濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7g/L,Na+濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7g/L時,考察無機鹽離子對乳糖酸產(chǎn)量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計

1.2.4.1 Plackett-Burman設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選用N=8的Plackett-Burman設(shè)計對發(fā)酵培養(yǎng)基中的8個組分的重要性進行考察,每個因素取高低兩個水平,高水平約為低水平的1.25倍,每個實驗組設(shè)置3個平行,以乳糖酸產(chǎn)量的平均值為響應(yīng)值Y,實驗因素水平見表1。用Design Expert8.0.5軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理,比較各因素的t值和可信度。

表1 Plackett-Burman實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.4.2 最陡爬坡實驗 對Plackett-Burman 實驗的因素作顯著性分析,找出主要因素。根據(jù)擬合函數(shù)回歸系數(shù)的符號和大小來設(shè)計主要因素的最陡上升路徑,正效應(yīng)的因素取較高值,負效應(yīng)的因素取較低值。實驗組數(shù)由經(jīng)驗來定,步長由主要因素的效應(yīng)值確定。通過使主要因素同時朝響應(yīng)值增大的方向變化,找出峰值,從而逼近最大的響應(yīng)區(qū)域,乳糖酸含量最高的處理,即為下一步響應(yīng)面分析的中心點。

1.2.4.3 Box-Behnken實驗設(shè)計 選擇Plackett-Burman實驗中對RsoultellaterrigenaY20乳糖酸的產(chǎn)量有顯著性影響的三個因素作為Box-Behnken設(shè)計所要考察的變量并對其進行三水平(-1、0、+1)編碼,從而獲得乳糖酸產(chǎn)量的最佳培養(yǎng)基組成,實驗因素與水平設(shè)計見表2。

表2 Box-Behnken實驗的因素與水平設(shè)計Table 2 Factors and levels of Box-Behnken Design

1.2.4.4 模型驗證 用Design Expert8.0.5軟件對多元函數(shù)進行擬合和方差分析,并得到最佳培養(yǎng)基組合,再按照所得到的參數(shù)進行驗證實驗,以檢驗?zāi)Ｐ偷闹貜?fù)性和可靠性。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳糖酸含量的測定

配制乳糖酸標樣的濃度分別為25、50、75、100、125、150mg/mL的梯度溶液,用高效液相色譜法測定其峰面積,繪制乳糖酸標準曲線,乳糖酸標準曲線見圖1。

圖1 乳糖酸標準曲線 Fig.1 Lactobionic acid standard curve

乳糖酸的產(chǎn)量與峰面積符合線性相關(guān)方程y=3907.2x-2657.1,x代表乳糖酸濃度,y代表峰面積,相關(guān)系數(shù)R2=0.9993,說明該方程具有很好的相關(guān)性,可用于乳糖酸含量的測定。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 氮源種類對乳糖酸產(chǎn)量的影響 由圖2可知,在上述供試的6種氮源中,硝酸銨和蛋白胨對乳糖酸的產(chǎn)量影響較大且影響效果差不多,這是因為該菌利用氮源的能力非常強,既可以利用無機氮源也可以利用有機氮源,無機氮源有硫酸銨、硝酸銨和尿素,其中硝酸銨的含氮量為35%,大于硫酸銨的含氮量,所以乳糖酸的產(chǎn)量也相對較高。雖然尿素的含氮量為46.7%,但是該菌能以尿素為氮源,是由于該菌體內(nèi)含有脲酶,脲酶的最適溫度為60℃左右,而乳糖氧化酶的最適溫度在30℃左右,而脲酶的活性受溫度影響較大,因此利用尿素為氮源產(chǎn)乳糖酸的含量就會大幅下降。有機氮源中蛋白胨的含氮量≥12%,牛肉膏的含氮量≥7%,胰蛋白胨的含氮量≥10%,所以該菌利用蛋白胨產(chǎn)乳糖酸的能力較強,而且該菌利用有機氮源的能力要高于無機氮源,所以導(dǎo)致硝酸銨和蛋白胨的影響效果相似?？紤]到有機氮源和無機氮源的搭配,故選硝酸銨和蛋白胨為復(fù)合氮源。

圖2 不同氮源對乳糖酸產(chǎn)量的影響 Fig.2 Different nitrogen sources on the influence of Lactobionic Acid production

2.2.2 氮源含量對乳糖酸產(chǎn)量的影響 選擇單一氮源蛋白胨和硝酸銨分別測定它們的乳糖酸產(chǎn)量。由圖3可知,起初乳糖酸產(chǎn)量隨著氮源含量的增加而增加,但到氮源含量達到一定值后,乳糖酸產(chǎn)量基本維持恒定。這是因為起初底物不足,乳糖酸的產(chǎn)量會隨著氮源含量的增加而增加,當增加到一定值時,由于該菌中乳糖氧化酶的含量是有一定限度的,不會隨之增加,所以乳糖酸的產(chǎn)量基本維持恒定。

2.2.3 碳源含量對RsoultellaterrigenaY20乳糖酸產(chǎn)量的影響 由圖4可知,隨著乳糖含量的增加,乳糖酸產(chǎn)量逐漸增大,當培養(yǎng)基中乳糖含量達到10%左右時,乳糖酸產(chǎn)量達到最大值,之后隨著乳糖含量的增多,反而有下降的趨勢,這可能是因為,當?shù)孜餄舛炔蛔銜r,乳糖酸的產(chǎn)量會隨著底物濃度的增高而增高,但是底物濃度過高會抑制菌體的生長,進而會減少乳糖酸的分泌和積累。

圖3 氮源含量對乳糖酸產(chǎn)量的影響 Fig.3 Nitrogen sources on the influence of Lactobionic Acid production

圖4 碳源含量對乳糖酸產(chǎn)量的影響 Fig.4 Carbon source content on the influence of Lactobionic Acid production

2.2.4 pH對RsoultellaterrigenaY20乳糖酸產(chǎn)量的影響 由圖5可知,土生拉烏爾菌RsoultellaterrigenaY20的最適pH為7.0左右,此時乳糖酸的產(chǎn)量最高達89.25g/L。pH過高或過低可能會影響菌體中乳糖氧化酶的活性,進而影響乳糖酸的產(chǎn)量。

圖5 pH對乳糖酸產(chǎn)量的影響 Fig.5 pH on the influence of Lactobionic Acid production

2.2.5 無機鹽離子濃度對乳糖酸產(chǎn)量的影響 由上圖可知,土生拉烏爾菌RsoultellaterrigenaY20的乳糖酸產(chǎn)量隨離子濃度的增大而增大,之后趨于穩(wěn)定,這可能是因為Mg2+對乳糖氧化酶活性的高低有一定的影響,Na+主要影響菌體的形態(tài)和滲透壓,所以隨著離子濃度的增大,對乳糖酸的產(chǎn)量均有一定的促進作用,但這種促進作用不可能是無限的,當離子濃度達到一定值時,促進作用減弱。

圖6 無機鹽離子對乳糖酸產(chǎn)量的影響 Fig.6 Inorganic salt ion on the influence of Lactobionic Acid production

2.3 Plackett-Burman實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,按照N=12的8因素2水平Plackett-Burman設(shè)計進行實驗,每組3個平行,搖瓶發(fā)酵的結(jié)果取平均值,響應(yīng)值為乳糖酸產(chǎn)量。Plackett-Burman設(shè)計及響應(yīng)值見表3,各因素效應(yīng)及顯著性分析見表4。

表3 Plackett-Burman設(shè)計與結(jié)果Table 3 Plackett-Burman design and results of

表4 Plackett-Burman各因素效應(yīng)及顯著性分析Table 4 Plackett-Burman factors effect and significant analysis

由表3可看出,KH2PO4表現(xiàn)為負效應(yīng),其余均為正效應(yīng)?？尚哦却笥?0%的因素為乳糖、硝酸銨、蛋白胨和初始pH,其中乳糖的可信度大于95%,表現(xiàn)為極顯著。

2.4 最陡爬坡實驗

Plackett-Burman實驗篩選出的三個最顯著因素全為正效應(yīng),其濃度水平應(yīng)增加,根據(jù)三個因素的效應(yīng)值大小設(shè)計它們的變化方向及步長進行最陡爬坡實驗[16],實驗設(shè)計結(jié)果見表5。

表5 最陡爬坡實驗結(jié)果Table 5 Results of steepest ascent test

從表5可看出,最優(yōu)培養(yǎng)基條件在第3組實驗附近,因此以第3組的水平作為響應(yīng)面實驗的中心點,即乳糖110g/L,蛋白胨17.5g/L,硝酸銨2.9g/L。

2.5 Box-Behnken實驗結(jié)果分析

根據(jù)PB實驗和最陡爬坡實驗結(jié)果確定Box-Behnken實驗的三個因素及水平,Box-Behnken實驗結(jié)果見表6,利用Design Export8.0.5軟件對Box-Behnken實驗的結(jié)果進行回歸擬合,得到響應(yīng)值Y與因子X之間的回歸方程:Y=93.16+4.24A+5.82B+1.87C-1.30AB-0.34AC+1.16BC-9.38A2+1.32B2-1.19C2。

表6 Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

根據(jù)表6的結(jié)果,運用Design Export8.0.5軟件對其進行方差分析和模型的顯著性分析,結(jié)果見表7。

表7 回歸方程的方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

從表7中可看出,模型p<0.0001,高度顯著,失擬項p=0.8293,失擬不顯著,相關(guān)系數(shù)R2=0.9935說明該模型與實際實驗擬合很好,調(diào)整后的R2=0.9851,即表明該模型可以解釋98.51%的發(fā)酵產(chǎn)乳糖酸水平的變化,進一步說明了回歸方程的擬合程度較好[17]。各因素的回歸系數(shù)及方差分析顯示,因素A、B、C表現(xiàn)為極顯著,二次項A2表現(xiàn)為極顯著,B2和C2表現(xiàn)為顯著,一次項中的AB和BC表現(xiàn)為顯著,影響大小的先后順序為B>A>C,說明實驗中的各個因素對響應(yīng)值的影響并非簡單的線性關(guān)系,而是具有很好的交互性。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的分析

由二次回歸方程所得到的響應(yīng)面圖及相應(yīng)的等高線圖見圖7～圖9。各因素交互作用對響應(yīng)值乳糖酸產(chǎn)量的影響由圖可直觀地反映出來。

圖7 Y=f(A,B)的響應(yīng)面分析圖及其等高線圖 Fig.7 Response surface plot and contour plot of Y=f(A,B)

圖7表明,在硝酸銨一定的情況下,蛋白胨和乳糖的交互作用顯著,隨著蛋白胨和乳糖含量的增加,乳糖酸的產(chǎn)量開始不斷提高,后期呈現(xiàn)小幅下降。一定程度上,提高培養(yǎng)基中蛋白胨和乳糖的含量有利于提高乳糖酸的產(chǎn)量,蛋白胨的變化對乳糖酸產(chǎn)量的影響沒有乳糖明顯,乳糖濃度過高會抑制菌體生長,不利于乳糖酸產(chǎn)量的增加。

由圖8可知,在蛋白胨一定的情況下,隨著硝酸銨和乳糖含量的增加,乳糖酸的產(chǎn)量開始不斷提高,后期呈現(xiàn)小幅下降。一定程度上,提高培養(yǎng)基中硝酸銨和乳糖的含量有利于提高乳糖酸的分泌和積累,但乳糖濃度過高會抑制菌體生長,不利于乳糖酸產(chǎn)量的增加。

圖8 Y=f(A,C)的響應(yīng)面分析圖及其等高線圖 Fig.8 Response surface plot and contour plot of Y=f(A,C)

由圖9可知,在乳糖一定的情況下,蛋白胨和硝酸銨的交互作用較顯著,隨著蛋白胨和硝酸銨含量的增加,乳糖酸的產(chǎn)量不斷提高,但硝酸銨對乳糖酸產(chǎn)量的影響不及蛋白胨對乳糖酸產(chǎn)量的影響。

圖9 Y=f(B,C)的響應(yīng)面分析圖及其等高線圖 Fig.9 Response surface plot and contour plot of Y=f(B,C)

2.7 培養(yǎng)基最佳濃度的確定

通過Design Expert8.0.5軟件分析得到最佳培養(yǎng)基組成:乳糖110.28g/L,蛋白胨19.00g/L,硝酸銨3.00g/L,在此條件下的乳糖酸產(chǎn)量的理論值為102.328g/L。

2.8 最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的驗證

為了驗證建立的模型與實驗結(jié)果是否相符,根據(jù)最佳培養(yǎng)基組成配制發(fā)酵培養(yǎng)基,做3次平行實驗,RsoultellaterrigenaY20的乳糖酸產(chǎn)量為102.614g/L,與預(yù)測值相近。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,經(jīng)Plackett-Burman實驗確定乳糖、蛋白胨和硝酸銨為主要影響因素,在此基礎(chǔ)上進行最陡爬坡實驗,確定最佳響應(yīng)面區(qū)域,然后采用Box-Behnken設(shè)計和Design Expert8.0.5軟件分析計算,得到這3種因素的添加量:乳糖110.28g/L,蛋白胨19.00g/L,硝酸銨3.00g/L,經(jīng)實驗驗證,在此條件下乳糖酸產(chǎn)量為102.614g/L,轉(zhuǎn)化率為93.05%,比優(yōu)化前的93.84g/L提高了9.35%。

利用微生物法將乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸是一種簡單而有效的方法,生產(chǎn)成本較低,利于工業(yè)化生產(chǎn)?？梢詫ε囵B(yǎng)基的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,以期進一步地提高乳糖酸的產(chǎn)量。

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