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(廣州市微生物研究所,廣東廣州 510663)

抗菌肽屬于生物體內(nèi)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的一種生物活性多肽小分子,分子量在2000～7000左右,由20～60個(gè)氨基酸殘基組成[1]?？咕目咕V比傳統(tǒng)抗生素廣,抗菌活性高[2],既能抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌,又有抗真菌和病毒的作用[3]。

天蠶素抗菌肽在1972年首次分離得到是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物抗菌肽[4],其作用機(jī)理是破壞病原菌細(xì)胞膜,從而達(dá)到抗菌作用,其作用不涉及特定靶位,因此幾乎不產(chǎn)生抗藥性。比起傳統(tǒng)抗生素,天蠶素抗菌肽具有無殘留、低耐藥性的特點(diǎn),因此具有廣闊的前景。目前天蠶素抗菌肽發(fā)現(xiàn)大約有89種[5],部分已被利用基因工程技術(shù)方法將其表達(dá)[6]。其中利用枯草芽孢桿菌表達(dá)載體表達(dá)的天蠶素抗菌肽具有比其他抗菌肽活性更高的特點(diǎn)[7]。

目前,對(duì)抗菌肽的發(fā)酵已展開廣泛的研究,近年已有報(bào)道用傳統(tǒng)單因素法和正交設(shè)計(jì)法對(duì)天蠶素類抗菌肽的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化[8],但該方法優(yōu)化出的方案具有局限性,會(huì)忽略多個(gè)因子之間的交互作用,得到的方案通常不是最優(yōu)方案。Plackett-Burman和響應(yīng)面分析法,在微生物培養(yǎng)條件的優(yōu)化工作中取得良好的效果,本研究選取8個(gè)對(duì)天蠶素抗菌肽生產(chǎn)菌株的相關(guān)因子進(jìn)行設(shè)計(jì),篩選出對(duì)其分泌抗菌肽顯著影響因子,再采用響應(yīng)面分析的方法,以產(chǎn)生的抗菌肽殺菌效價(jià)為響應(yīng)值,研究顯著因子對(duì)效價(jià)的影響,得到最優(yōu)條件,并在500L中試水平的發(fā)酵罐上進(jìn)行驗(yàn)證,以期為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

抗菌肽生產(chǎn)菌KJ05和大腸桿菌K12D31為本課題組保藏。種子培養(yǎng)基:甘油2%,蛋白胨2%,酵母膏1%,pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖3%,蛋白胨1%,酵母膏2%,NaCl 0.5%,pH自然。固態(tài)大腸桿菌培養(yǎng)基:蛋白胨1%,酵母粉0.5%,NaCl 0.5%,瓊脂粉2%,pH自然。

pHS-25 數(shù)顯酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠;ZY-3000IV抑菌圈自動(dòng)測(cè)量分析儀 北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司;50L、500L不銹鋼發(fā)酵罐 上海洋格生物工程設(shè)備有限公司。

1.2 培養(yǎng)方法

斜面菌株活化后,接入種子搖瓶中,200r/min、30℃培養(yǎng)20h后接種5%到發(fā)酵培養(yǎng)基中,200r/min、30℃培養(yǎng)24h后取樣進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。

1.3 效價(jià)測(cè)定方法

配制固態(tài)大腸桿菌培養(yǎng)基,滅菌后冷卻至50℃時(shí)加入6mL至已滅菌平皿(Φ=75mm)中,指示菌大腸桿菌K12D31菌液(濃度約106cfu/mL)5μL加入以上平皿中,迅速震蕩搖勻,水平放置,凝固后用打孔器按指定位置(2.7mm)打孔,備用。

發(fā)酵液3000r/min離心5min后,取5μL加入到打孔處,每個(gè)樣品重復(fù)3次,37℃培養(yǎng)18h,用抑菌圈測(cè)定儀測(cè)定抑菌圈直徑(mm),按照下列公式進(jìn)行效價(jià)計(jì)算[9]:

殺菌效價(jià)(U/mL)=2x×1000

其中x=(抑菌圈直徑-2.7)/2.1

1.4 培養(yǎng)基優(yōu)化方法

1.4.1 Plackett-Burman法篩選影響分泌抗菌肽效價(jià)的重要因素 影響天蠶素抗菌肽分泌殺菌效價(jià)的可能因素包括:葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、氯化鈉、接種量、接種齡、初始pH以及培養(yǎng)溫度等8個(gè)因素,用Design Expert(version 8.0.5)軟件進(jìn)行N=11的Plackett-Burman設(shè)計(jì)[10]如表1所示,通過實(shí)驗(yàn)確定各因素的顯著水平。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因子水平表Table 1 Levels and factors of Plackett-Burman design experiment

1.4.2 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 從Plachett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,葡萄糖、接種量、起始pH為影響分泌抗菌肽殺菌效價(jià)的關(guān)鍵因素,因此選擇該三因素作為研究對(duì)象,以抗菌肽的殺菌效價(jià)作為響應(yīng)值設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn),軟件使用Design Expert(version 8.0.5)設(shè)計(jì)。中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)定實(shí)驗(yàn)因素水平和編碼如表2所示。并得出最優(yōu)條件。

表2 實(shí)驗(yàn)因素水平編碼Table 2 Factors and code levels of central composite design experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman法篩選影響分泌抗菌肽效價(jià)的重要因素

以分泌的抗菌肽殺菌效價(jià)為響應(yīng)值分別計(jì)算葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、氯化鈉、接種量、接種齡、初始pH以及培養(yǎng)溫度的顯著水平。按實(shí)驗(yàn)因素水平,設(shè)計(jì)出N=11的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),進(jìn)行14次,得到相應(yīng)的天蠶素抗菌肽殺菌效價(jià)(U/mL)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。并對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行顯著性分析,具體見表4。

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)各因素效應(yīng)分析Table 4 Effect analysis of the Plackett-Burman design factors

從表4分析可知,因素B、F、H的p值均小于0.05,故為影響天蠶素抗菌肽效價(jià)的顯著因子。所以選擇該三個(gè)因素作為主要研究對(duì)象進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化工作,其余因素按照其相應(yīng)的T值正負(fù)效應(yīng)選擇高水平與低水平:酵母膏、接種齡、氯化鈉為高水平,蛋白胨、培養(yǎng)溫度為低水平,即以后優(yōu)化培養(yǎng)基為:酵母膏(2.5%)、蛋白胨(1%)、氯化鈉(0.6%)、接種齡(26h)、培養(yǎng)溫度(30℃)。

2.2 中心組合實(shí)驗(yàn)

2.2.1 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選取對(duì)天蠶素抗菌肽效價(jià)影響最大的因子葡萄糖、起始pH和接種量進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn),以確定其濃度范圍和步長(zhǎng)。其他因子選取中心點(diǎn)值,根據(jù)分析計(jì)算得出葡萄糖、起始pH和接種量的步長(zhǎng),設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)表如表5所示,以抗菌肽效價(jià)為響應(yīng)值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of Plackett-Burman design

以上6組實(shí)驗(yàn)中,第三組中的抗菌肽效價(jià)最高,達(dá)12570U/mL。因此,響應(yīng)面中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中選取第三組數(shù)據(jù)位實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of steepest ascent experiment

2.2.2 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 三個(gè)主要顯著因素葡萄糖、起始pH、接種量分別設(shè)為因素A、B、C,抗菌肽效價(jià)為響應(yīng)值Y,按照中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)定實(shí)驗(yàn)因素水平和編碼。設(shè)實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)重復(fù)次數(shù)為6,設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn),并根據(jù)20組實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組抗菌肽效價(jià),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,利用Design-Expert軟件的分析功能進(jìn)行分析如表7所示,得到編碼制的回歸方程:

Y=12639.19+605.05×A-197.04×B+605.05×C+203.13×A×B-374.37×A×C+334.38×B×C-1561.99×A2-861.95×B2-983.05×C2

通過Design-Expert軟件繪制結(jié)果響應(yīng)面圖,如圖1～圖3所示,可以看出該模型具有最優(yōu)解,利用軟件分析計(jì)算得最優(yōu)解為:葡萄糖(5.7%),接種量(5.6%),起始pH(6.4)。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)優(yōu)化后培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn):葡萄糖(5.7%),接種量(5.6%),起始pH(6.4)、酵母膏(2.5%)、蛋白胨(1%)、氯化鈉(0.6%)、接種齡(26h)、培養(yǎng)溫度(30℃),共進(jìn)行3組250mL搖瓶實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為:12806、13042、12710U/mL,平均效價(jià)為12852U/mL,證明該模型比較可靠,且較優(yōu)化前效價(jià)提高30.7%。

表6 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Result of central composite design

表7 回歸方程方差分析表Table 7 Analysis results of regression and variance

圖1 葡萄糖與接種量的響應(yīng)面圖 Fig.1 Response surface curve of the interaction between glucose and inoculation amount

圖2 葡萄糖與起始pH的響應(yīng)面圖 Fig.2 Response surface curve of the interaction between glucose and pH

圖3 接種量與起始pH的響應(yīng)面圖 Fig.3 Response surface curve of the interaction between inoculation amount and pH

2.4 發(fā)酵中試實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步確定該模型可靠性,在500L發(fā)酵罐上進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)條件按照優(yōu)化后條件,其余條件為通風(fēng)量0.6～0.8m3/h,攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min,罐壓保持0.4～0.6MPa。發(fā)酵20h后測(cè)得殺菌效價(jià)達(dá)15520U/mL,該結(jié)果明顯優(yōu)于搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測(cè)其原因在于發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中溶氧量明顯高于搖瓶,更利于菌體生長(zhǎng),代謝出的抗菌物質(zhì)能快速擴(kuò)散降低后期的反饋抑制作用。

3 結(jié)論

本文通過使用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出對(duì)天蠶素抗菌肽殺菌效價(jià)影響的顯著因子,對(duì)其再進(jìn)行梯度尋優(yōu)確定中心點(diǎn)以及步長(zhǎng),進(jìn)一步使用中心組合實(shí)驗(yàn)對(duì)顯著因子進(jìn)行優(yōu)化,得到回歸方程,求出最優(yōu)解。優(yōu)化后培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基為:葡萄糖(5.7%),接種量(5.6%),起始pH(6.4)、酵母膏(2.5%)、蛋白胨(1%)、氯化鈉(0.6%)、接種齡(26h)、培養(yǎng)溫度(30℃)。優(yōu)化后搖瓶殺菌效價(jià)為12852U/mL,較優(yōu)化前提高了30.7%,優(yōu)化后的培養(yǎng)基更適合KJ05的生長(zhǎng)以及抗菌肽的合成與分泌,根據(jù)其條件進(jìn)行500L發(fā)酵罐中試實(shí)驗(yàn),利用50L發(fā)酵罐作為種子培養(yǎng)罐,使其接種量達(dá)到5.6%,其發(fā)酵液效價(jià)能達(dá)到15520U/mL。這表明該模型較可靠,具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,能在今后天蠶素抗菌肽大規(guī)模生產(chǎn)中提供理論依據(jù)。

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