李螢 劉玲 張佳鈺 范小敏 陳祥平 柯皓天 沈曦彤 陳仁芳

（1.西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716；2.四川省絲綢工程技術(shù)研究中心，成都 610031）

桑樹(shù)品種分子親緣關(guān)系分析是桑樹(shù)學(xué)科最基礎(chǔ)研究，對(duì)桑樹(shù)品種的保存、雜交育種親本選擇、分子輔助育種、品種資源開(kāi)發(fā)利用均具有重要作用。其分析方法已見(jiàn)核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers，ITS）標(biāo)記[1－4]，也見(jiàn)于隨機(jī)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）標(biāo)記[4－18]。本文用RAPD方法對(duì)四川省桑樹(shù)品種的7個(gè)特色親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料取于四川省江油市蠶桑技術(shù)研究所桑品種園。為了鑒定7個(gè)特色桑樹(shù)品種親緣關(guān)系，參照董若鋮等（2012）研究，選取浙江裂葉火桑、四川鬼桑、斯里蘭卡桑、滎經(jīng)川桑、湖北蒙桑、新疆黑桑、云南毛葉奶桑、金佛山華桑、重慶構(gòu)樹(shù)、廣東荊桑、欽州長(zhǎng)果桑、廣西雞桑、云南長(zhǎng)穗桑、劍持、咸豐長(zhǎng)穗桑、云南光葉桑、滇桑為評(píng)鑒系統(tǒng)（表1）。

1.2 DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

總DNA提取采用稍加改進(jìn)的CTAB法[20]，從約0.15g的硅膠干燥桑葉中提取，質(zhì)量和濃度用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技公司））檢測(cè)，并用1%瓊脂糖凝膠電泳，λDNA/HindⅢmarker在紫外分光核酸測(cè)定儀（GENEQUANT，Eppendorf，Gemany）檢測(cè)復(fù)核。

1.3 引物篩選

根據(jù)張有做等（1998）、趙衛(wèi)國(guó)等（2000）、付大煦等（2005）、樓程富等（2002）的研究，用如下32個(gè)引物進(jìn)行篩選。

表1 研究材料

先用一個(gè)DNA樣品，對(duì)引物初選，再用4個(gè)樣品DNA進(jìn)行第二次篩選，選出多態(tài)性高的引物用于RAPD實(shí)驗(yàn)。

1.4 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

RAPD擴(kuò)增反應(yīng)在Gene Company Limited PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)總體積20μl，其中含模板（TEMPLATE）1μl（25ng/μl）、10×PCR buffer 2μl、引物2μl（50ng/μl）、Mg2＋2μl（2.5 mM）、dNTPs2μl（2.5mM）、Ex－taq 0.3μl（5U/μl），用ddH2O補(bǔ)至20μl，最后加礦物油0.3μl。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性4min；95℃變性45s；36℃退火45s；72℃延伸90s；38個(gè)循環(huán)，72℃延伸8min，反應(yīng)結(jié)束控制在12℃。每次PCR反應(yīng)均設(shè)不含模板DNA的空白對(duì)照。重復(fù)兩次，確定所得條帶的可重復(fù)性。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓110V（4V/cm，穩(wěn)壓）電泳約20min，溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色5～10min，在BIO－RAD Gel DocTM EZ Imager 2000凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)）拍照記錄。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)擴(kuò)增條帶的遷移率，同一遷移率的條帶用引物名＋分子量命名，有條帶的記為“1”，無(wú)條帶的記為“0”，形成數(shù)據(jù)矩陣，按Nei's等的方法[21]，輸入Popgen32軟件（版本PHYLIP3.5）計(jì)算遺傳相似度genetic identity（I）與遺傳距離Genetic distance（D），根據(jù)遺傳距離用鄰接法聚類(lèi)分析。得到聚類(lèi)圖與ITS分支圖比較。

2 研究結(jié)果

2.1 引物篩選及PCR擴(kuò)增

32個(gè)引物第一次篩選，選出多態(tài)性高的17個(gè)引物。第二次復(fù)選，選出多態(tài)性高的9個(gè)引物進(jìn)行RAPD實(shí)驗(yàn)。引物如下：

9個(gè)引物，對(duì)24個(gè)樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出409條譜帶，形成不同遷移率66條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增7.3條，片段大小在200～2 200bp，顯示出豐富的多態(tài)性。圖1為J－20號(hào)引物擴(kuò)增結(jié)果。

圖1 J－20號(hào)引物RAPD－PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 遺傳一致度（I）與遺傳距離（D）

將有條帶的記為“1”，無(wú)條帶的記為“0”，形成數(shù)據(jù)矩陣，輸入Popgen32軟件（版本PHYLIP3.5）計(jì)算遺傳一致度（I）和遺傳距離（D），計(jì)算結(jié)果：盤(pán)桑2號(hào)與劍持遺傳距離最近（0.248 9）；圌桑14與金佛山華桑遺傳距離最近（0）；圌桑12號(hào)與廣西雞桑遺傳距離最近（0.145 7）；圌桑11號(hào)與金佛山華桑遺傳距離最近（0.052 2）；圌桑10號(hào)與浙江裂葉火桑、保康蒙桑遺傳距離最近（0.248 9）；圌桑6號(hào)與圌桑14號(hào)遺傳距離最近（0.206 3）；圌桑2號(hào)與圌桑10號(hào)遺傳距離最近（0.466 6）（表2）。

表2 四川省幾個(gè)特色桑樹(shù)品種遺傳一致性和遺傳距離

2.3 聚類(lèi)分析

基于Nei's（1979）遺傳距離、RAPD資料、鄰接法，UPGMA聚類(lèi)，得聚類(lèi)圖。圌桑10號(hào)、盤(pán)桑2號(hào)與浙江裂葉火桑、四川鬼桑、劍持親緣關(guān)系近；圌桑6號(hào)、圌桑12號(hào)、圌桑11號(hào)、圌桑14號(hào)與斯里蘭卡桑、?？得缮?、廣西雞桑、滎經(jīng)川桑、金佛山華親緣關(guān)系近；圌桑2號(hào)與廣東荊桑親緣關(guān)系近。聚類(lèi)圖首先將廣東荊桑、圌桑2號(hào)分出，將其它材料聚為2大類(lèi)。第一大類(lèi)比較復(fù)雜：欽州長(zhǎng)果桑單獨(dú)分出；圌桑10號(hào)、盤(pán)桑2號(hào)、浙江裂葉火桑、四川鬼桑、劍持聚為一支，圌桑6號(hào)、圌桑12號(hào)、圌桑11號(hào)、圌桑14號(hào)、斯里蘭卡桑、?？得缮?、廣西雞桑、滎經(jīng)川桑、金佛山華聚為一支，重慶構(gòu)樹(shù)與云南長(zhǎng)穗桑被聚在第一大類(lèi)二支之間；第二大類(lèi)包括新疆黑桑、云南毛葉奶桑、咸豐長(zhǎng)穗桑、云南光葉桑、云南滇桑（圖1）。

3 討論

3.1 RAPD資料聚類(lèi)分析能將供試的桑樹(shù)品種細(xì)分

基于RAPD聚類(lèi)圖，能很好地將供試的四川7個(gè)特色桑樹(shù)品種分開(kāi)。如圌桑10號(hào)、盤(pán)桑2號(hào)與浙江裂葉火桑、四川鬼桑、劍持聚在一起；圌桑6號(hào)、圌桑12號(hào)、圌桑11號(hào)、圌桑14號(hào)與斯里蘭卡桑、?？得缮！V西雞桑、滎經(jīng)川桑、金佛山華聚在一起；圌桑2號(hào)與廣東荊桑聚在一起。而基于ITS資料分支圖，并沒(méi)有將供試的品種完全分開(kāi)。

圖1 基于UPGMA 7個(gè)特色桑品種聚類(lèi)圖

3.2 RAPD資料適合種內(nèi)親緣關(guān)系分析，不適合種以上親緣關(guān)系分析

RAPD資料屬等位基因頻率資料，適合種內(nèi)水平親緣關(guān)系的分析。在分析桑屬種間或?qū)匍g的親緣關(guān)系時(shí)，由于不同種的擴(kuò)增片段有時(shí)并不同源[22－24]，聚類(lèi)分析結(jié)果與中國(guó)植物志桑屬的分類(lèi)相矛盾，難以解釋。如本研究廣東荊桑與圌桑2號(hào)首先分出；將欽州長(zhǎng)果桑聚在第一大類(lèi)，單獨(dú)分出；將滎經(jīng)川桑、金佛山華桑聚在第一大類(lèi)，均反映了RAPD資料分析桑屬種以上水平親緣關(guān)系的缺陷。

3.3 RAPD資料無(wú)法設(shè)定外類(lèi)群

隨機(jī)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)由Willams和Welsh等先后于1990提出[25－26]。該技術(shù)是建立在DNA聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain reaction，PCR）基礎(chǔ)上，對(duì)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)。以單個(gè)人工隨機(jī)合成的寡核苷酸為引物，以生物的基因組DNA為模板，在Taq酶的作用下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，用擴(kuò)增產(chǎn)物不同長(zhǎng)度來(lái)檢測(cè)DNA的多態(tài)性。用該多態(tài)性反映基因組的多態(tài)性，進(jìn)而分析親緣關(guān)系。該方法無(wú)法假定外類(lèi)群，只能將RAPD擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)換成“0”“1”數(shù)據(jù)，用遺傳相似性和遺傳距離分析親緣關(guān)系。例如本研究實(shí)驗(yàn)材料構(gòu)樹(shù)是作為外類(lèi)群參與分析，由于無(wú)法設(shè)定外類(lèi)群，在聚類(lèi)圖卻聚在了第一大類(lèi)兩支之間，難以解釋。

通過(guò)比較本研究聚類(lèi)圖與董若鋮等，2012基于ITS分支圖，兩種資料各有長(zhǎng)處，建議在分析桑屬的系統(tǒng)學(xué)時(shí)，先用ITS資料進(jìn)行初步分類(lèi)，確定親緣關(guān)系大致框架，再用RAPD資料對(duì)種下不同品種進(jìn)行細(xì)分。

[1]史全良，趙衛(wèi)國(guó).桑樹(shù)ITS序列測(cè)定及特點(diǎn)的初步分析[J].蠶業(yè)科學(xué)，2001，27（2）：140－142.

[2]趙衛(wèi)國(guó)，潘一樂(lè)，張志芳.桑屬植物ITS序列研究與系統(tǒng)發(fā)育分析[J].蠶業(yè)科學(xué)，2004.1.

[3]陳仁芳，余茂德，劉秀群，等.桑種質(zhì)資源ITS序列與系統(tǒng)進(jìn)化分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（9）：1771－1781.

[4]董若鋮，陳祥平，范小敏，等.四川幾個(gè)特色桑樹(shù)品種ITS序列與親緣關(guān)系分析[J].四川蠶業(yè)，2012（2）：4－7.

[5]菅貴史，平田豐，町內(nèi)秀紀(jì)，等.利用RAPD技術(shù)評(píng)價(jià)桑品種（日文）[J].日本蠶絲學(xué)會(huì)第65次講演要旨，1995.

[6]向仲懷，張孝勇，余茂德，等.采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)（RAPD）在桑屬植物系統(tǒng)學(xué)研究的應(yīng)用初報(bào)[J].蠶業(yè)科學(xué)，1995（4）：203－208.

[7]樓程富，張有做，張耀洲，等.桑樹(shù)隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性研究[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，22（2）：149－151.

[8]馮麗春，楊光偉，余茂德，等.桑樹(shù)栽培種的隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性（RAPD）研究[J].蠶業(yè)科學(xué)，1996，23（3）：153－159.

[9]馮麗春，楊光偉，余茂德，等.利用RAPD對(duì)桑屬植物種間親緣關(guān)系的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997，30（1）：52－56.

[10]張有做，樓程富，周金妹，等.不同倍性桑品種基因組DNA多態(tài)性比較[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，24（1）：79－81.

[11]趙衛(wèi)國(guó)，潘一樂(lè)，黃敏仁.桑屬種質(zhì)資源的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA研究[J].蠶業(yè)科學(xué)，2000，26（4）：398－402.

[12]趙衛(wèi)國(guó).桑種質(zhì)資源的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPDs）及葉綠體基因組DNA的研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2001.6.

[13]趙衛(wèi)國(guó)，潘一樂(lè)，黃敏仁.桑屬種質(zhì)資源的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA研究[J].蠶業(yè)科學(xué)，2002.4.

[14]焦鋒，樓程富，張有做，等.桑樹(shù)變異株系基因組擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD研究[J].蠶業(yè)科學(xué)，2001，27（3）：165－169.

[15]楊光偉，馮麗春，敬成俊，等.桑樹(shù)種群遺傳結(jié)構(gòu)變異分析[J].蠶業(yè)科學(xué)，2003，29（4）：6－12.

[16]楊光偉.中國(guó)桑屬（Morus L.）植物遺傳結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育分析[D].重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003b：24－29，51－74.

[17]傅大煦，張輝，陳紋，等.新疆藥用桑樹(shù)9個(gè)栽培群體的RAPD分析[J].中草藥，2004，35（9）：3501－6501.

[18]買(mǎi)買(mǎi)提依明，吳麗莉，郭洪榮，等.新疆桑種質(zhì)資源隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性（RAPD）研究[J].蠶業(yè)科學(xué)，2004（1）：112－114.

[19]付大煦.新疆桑屬植物栽培居群的遺傳多樣性研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2005（2）：772－783.

[20]Weising K H，Wolff K，Meyer W.DNA Fingerprinting in Plants and Fungi.Boca Raton[J].Florida，US：CRC cPress，1995：50－54.

[21]Nei N.Mathematical model for studyig genetic variation in tem of restriction endonuclease[J].Proc.Natl.Acad Sei.USA，1979，76（3）：5269－5273.

[22]汪小全，鄒喻蘋(píng)，張大明.銀杉遺傳多樣性的RAPD分析[J].中國(guó)科學(xué)（C輯），1996（5）：436－441.

[23]汪小全，鄒喻蘋(píng)，張大明.RAPD應(yīng)用于遺傳多樣性分析和系統(tǒng)學(xué)研究中的問(wèn)題[J].植物學(xué)報(bào)，1996（12）：954－962..

[24]馬文輝，何平，袁小鳳，等.RAPD標(biāo)記在植物系統(tǒng)進(jìn)化研究中的應(yīng)用[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999，24（4）：482－491.

[25]Williams J K.et al.DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucteic Acid Res，1990，18：6531－6535.

[26]Welsh J，Mcclelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arimers[J].Nucteic Acid Res，1990，18（24）：7213－7218.