余惠珍，朱鵬立，黃舒潔，向紅，潘瑋，張楓，林帆

（福建省立醫(yī)院老年醫(yī)學研究室，福建省臨床老年病研究所，福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院，福州350000）

組織激肽釋放酶改善大鼠心肌重塑的實驗研究

余惠珍，朱鵬立，黃舒潔，向紅，潘瑋，張楓，林帆

（福建省立醫(yī)院老年醫(yī)學研究室，福建省臨床老年病研究所，福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院，福州350000）

目的探討重組腺病毒介導的人組織激肽釋放酶（hTK1）基因過表達對大鼠心肌梗死后心肌結構、心肌膠原纖維以及新生血管的影響。方法結扎雄性Sprague-Dawley大鼠的左冠狀動脈前降支，建立急性心肌梗死模型。將含hTK1基因的重組腺病毒（Ad-hTK1）和對照病毒（1×1010PFU）注射到心肌梗死部位及其周邊區(qū)域。4周后處死大鼠，取出心臟、稱量、切片；通過熒光顯微鏡觀察心肌組織的綠色熒光表達；Western blot測定hTK1蛋白表達；HE染色觀察心肌組織結構，天然猩紅染色觀察膠原含量、分布，免疫組化法檢測新生血管密度。結果僅在Ad-hTK1組大鼠的心肌既有綠色熒光，又有hTK1蛋白表達。假手術組大鼠的心臟質(zhì)量、左室質(zhì)量、心肌膠原分布顯著低于心梗模型組，新生血管密度明顯高于模型組。但與對照病毒組相比，Ad-hTK1組大鼠的心臟質(zhì)量、左室質(zhì)量、左室質(zhì)量指數(shù)和心肌膠原纖維含量明顯降低（P＜0.05），心肌結構和新生血管密度明顯改善（P＜0.05）。結論重組腺病毒介導的組織激肽釋放酶基因過表達可改善心肌結構，增加梗死周圍心肌的新生血管形成，改善梗死后心肌重構。

人組織激肽釋放酶1；重組腺病毒；心肌梗死；心室重構

業(yè)已證實，心血管系統(tǒng)存在組織激肽釋放酶系統(tǒng)（kallikrein-kinin system，KKS），組織激肽釋放酶（tissue kallikrein，TK）酶解低分子激肽原產(chǎn)生緩激肽和賴氨酸緩激肽，與緩激肽B2受體結合后具有廣泛的生物學效應［1～3］。研究表明，在缺乏TK1小鼠中，血壓雖正常，但成年前可引起心血管畸形；TK1還具有降低血壓、改善大鼠頸動脈損傷后再狹窄、抑制心肌細胞凋亡、炎性反應，改善心肌缺血再灌注損傷［4～8］。本研究小組前期已成功構建重組腺病毒介導的人組織激肽釋放酶1（human tissue kallikrein 1，hTK1）基因過表達載體，干預大鼠的血管平滑肌細胞（VSMCs）和再狹窄模型，發(fā)現(xiàn)可抑制PDGF-BB誘導VSMCs的增殖和遷移，改善球囊損傷后的頸動脈新生內(nèi)膜形成［9～11］。本研究將含hTK1基因的重組腺病毒載體注射到大鼠的急性心肌梗死（acute myocarial infarction，AMI）后的心肌組織，觀察其對大鼠心肌梗死后的左心室心肌炎性反應、膠原纖維重排及新生血管等的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性清潔級Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，體質(zhì)量250～350 g，購自中國科學院上海斯萊克實驗動物中心，許可證號為2007-0005。大鼠飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學實驗動物中心屏障系統(tǒng)，許可證號：SYXK（閩）2008-0001。室溫20～25℃，空氣流通，相對濕度40%～60%；動物自由攝食飲水，飼料為鼠糧。飼料由上海必凱公司提供。適應性喂養(yǎng)2周。

1.2 主要試劑及儀器

含hTK1基因的重組腺病毒Ad-hTK1-IRESEGFP（Ad-hTK1）和對照病毒（Ad-IRES-EGFP，Ad-EGFP），其構建、擴增和純化及鑒定參照文獻9-11?？谷私M織激肽釋放酶抗體（美國Proteintech公司），其余蛋白免疫印跡法的試劑見前期實驗部分。熒光倒置相差顯微鏡，IX-70型，日本Olympus公司；CMIAS-B型多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)，北京航空航天大學圖象中心、空軍總醫(yī)院制造。Image Pro-Plus 5.0圖像處理分析軟件。

1.3 大鼠心肌梗死模型的建立及干預

通過結扎左冠狀動脈前降支建立大鼠心肌梗死模型［12］。禁食12 h，10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射淺麻醉，固定實驗動物于大鼠臺，連接心電圖，氣管插管與連接人工呼吸機，進行人工呼吸（潮氣量3 mL；頻率45次/min）。胸部去毛，消毒，沿左鎖骨中線縱行切開皮膚2 cm，在第四或五肋間鈍性分離肌層，打開胸腔，剪開心包，輕壓右側胸廓，擠出心臟。在左冠狀動脈前降支中上1/3處結扎。把心臟放回胸腔。經(jīng)肢體導聯(lián)心電圖證實多導聯(lián)ST段呈弓背向上抬高1 mV，局部心肌變暗紅節(jié)段運動不良，以上為左冠脈前降支結扎成功。結扎后1 h，干預組大鼠給予Ad-hTK1病毒（1×1010PFU）或?qū)φ詹《荆?×1010PFU），分6個點注射到心肌梗死部位（4個點）及其周邊區(qū)域（2個點）。逐層關閉胸腔，待動物蘇醒后拔氣管插管。假手術組的大鼠不結扎，僅在冠狀動脈前降支留置絲線，注射等量PBS液，余操作過程同干預組步驟。術后肌注青霉素10萬U/只，維持3 d。于干預4周處死大鼠。

1.4 心臟、心肌組織形態(tài)學指標檢測

4周后測量體質(zhì)量，處死大鼠后取出心臟，PBS沖洗，濾紙吸干后稱量全心質(zhì)量。剪去左、右心房，緊貼室間隔右下側剔除右心室游離壁，余下左心室，濾紙吸干后稱量左心室質(zhì)量。LVW/BW=左心室重量/體質(zhì)量。沿梗死區(qū)中部垂直于長軸的方向切取厚約6～8 μm的心肌組織切片，冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達。另取厚約3～5 mm的心肌組織塊，放入4%多聚甲醛緩沖液中固定24 h，常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋，切片備用，切片厚度約5 μm。余下部分經(jīng)液氮速凍后置-80℃冰箱保存，用于蛋白免疫印跡檢測。

1.5 HE染色觀察心肌結構變化

石蠟切片常規(guī)脫蠟、梯度乙醇水化；浸泡各3 min；PBS洗滌3次，蘇木精染液染色10 min；PBS洗滌3次，1%鹽酸乙醇分色約10 s（鏡檢控制，直至細胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止）；流水沖洗返藍約15～30 min，0.2%伊紅染液染色3 min；蒸餾水沖洗3次，梯度乙醇脫水；浸泡各3 min；二甲苯透明2次；中性樹膠封片。普通顯微鏡下觀察心肌組織結構。

1.6 心肌膠原表達的觀察

采用天狼猩紅-飽和苦味酸（PSR）染色法。石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，雙蒸水洗滌；加入Harris蘇木素液5 min后，用自來水洗滌10 min；鹽酸乙醇分色，水洗；天狼猩紅-飽和苦味酸染液染色30 min；無水乙醇分化與脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察心肌膠原的表達。采用全自動圖像分析系統(tǒng)對該染色切片進行分析。膠原分布容積=（膠原面積/左室總面積）×100%。

1.7 心肌新生微血管密度（MVD）檢測

取石蠟切片（厚度3 μm）。以一抗為小鼠抗大鼠CD34（來自美國Santa Cruz，公司），二抗為FITC標記的山羊抗小鼠的IgG抗體，進行心肌微血管進行免疫組化染色檢測，具體步驟按照免疫組化成套染色系統(tǒng)中的說明進行操作。染色后隨機抽取5份病理切片，參照Weidner方法計數(shù)新生血管。先在倒置熒光顯微鏡低倍鏡下（×100）確定5個血管密度最高的區(qū)域，然后在高倍鏡下（×200）計數(shù)視野內(nèi)被染成綠色的血管數(shù)，取血管數(shù)平均值為MVD。厚的平滑肌壁以及管腔直徑大于8倍紅細胞直徑的血管排除在外。

1.8 Western blot檢測大鼠心肌組織中的hTK1蛋白表達

大鼠心肌組織總蛋白的提?。捍笫笞笮氖医M織約100 mg置于懸浮緩沖液［0.1 mol/L氯化鈉，0.01 mol/L三羥甲基氨基甲烷氯pH7.6，0.001 mol/L乙二胺四乙酸pH8.0，1 μg/mL抑肽酶（1∶100），100 μg/mL苯甲基磺酰氟（PMSF）（1∶1 000）］。抑肽酶和PMSF臨用時加入。加入等體積的2×十二烷基磺酸鈉（臨用前加入5×二硫蘇糖醇液），超聲震蕩5 min，立即放入水浴鍋中100℃煮10 min，4℃10 000g離心10 min，取上清分裝，放入-70℃冰箱待用。以考馬斯亮藍法測定心肌組織蛋白含量。按預定順序用微量加樣器將樣品加于凝膠的加樣孔中，保證每樣品含蛋白50 μg。凝膠電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影等步驟見前期實驗。

2 結果

2.1 大鼠體質(zhì)量、左心臟質(zhì)量、左室質(zhì)量和左室質(zhì)量指數(shù)的比較

4周后，3組實驗大鼠體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），對照病毒組和h TK1組的心臟重量、左室重量、左室重量指數(shù)都明顯高于假手術組，而hTK1組的上述指標均明顯低于對照病毒組（P＜0.01），見表1。

表1 三組大鼠的體質(zhì)量、心臟質(zhì)量、左室質(zhì)量及左室質(zhì)量指數(shù)的比較Tab.1 Comparison of body weight，heart weight，left ventricle weight and left ventricle weight indexes in three groups

表1 三組大鼠的體質(zhì)量、心臟質(zhì)量、左室質(zhì)量及左室質(zhì)量指數(shù)的比較Tab.1 Comparison of body weight，heart weight，left ventricle weight and left ventricle weight indexes in three groups

1）P＜0.05 vs sham-operated group；2）P＜0.01 vs MI+Ad-EGFP（control adenovirus）. BW：body weight；HW：heart weight；LVW：left ventricle weight；LVW I：LVW/BW；MI：myocardial infarction.

?

2.2 各組大鼠心肌組織中hTK1的表達

熒光顯微鏡下觀察可見，假手術組大鼠心肌組織中無綠色熒光細胞，而對照病毒組和Ad-hTK1組可見大量的綠色熒光細胞，見圖1；通過Western blot法發(fā)現(xiàn)，僅在Ad-hTK1組大鼠心肌中才有hTK1蛋白表達，假手術組和對照病毒組卻無表達，見圖2。提示hTK1在大鼠心肌組織中獲得高效表達。

2.3 HE染色大鼠心肌結構觀察

假手術組大鼠心肌組織結構完整，心肌細胞核呈長橢圓形，位于肌纖維中央，心肌細胞無萎縮或肥大，無嗜伊紅濃染和壞死，間質(zhì)無明顯水腫和結締組織增生，未見血管擴張和管壁增厚，心肌纖維排列整齊，細胞間連接存在。對照病毒組大鼠梗死區(qū)肌纖維排列稀疏紊亂，肌絲斷裂，細胞核固縮、碎裂，包漿減少或缺失，間質(zhì)充血水腫和大量炎癥細胞浸潤，細胞間隙連接消失，明顯存在瘢痕組織纖維；Ad-hTK1組大鼠上述心肌結構改變明顯減輕。心肌纖維排列較整齊，心肌間質(zhì)水腫減輕，少量炎性細胞浸潤，見圖3。

圖2 3組中大鼠心肌組織中的hTK1蛋白表達情況Fig.2 hTK1 protein expression of myocardium in three groups by Western blot

圖3 HE染色大鼠心肌梗死干預后的左心室心肌形態(tài)結構的比較×100Fig.3 The histology and morphology of rat myocardium in three groups post-MI 4 weeks by HE staining×100

2.4 天狼猩紅染色結果

圖4中紅色為心肌膠原苦味酸-天狼猩紅染色顯示：假手術組的大鼠心肌組織很少紅色著色，對照病毒組著色最明顯成片分布，瘢痕組織明顯，AdhTK1組較對照病毒組顯著減少。心肌膠原容積分數(shù)（CVF）分析：與假手術組比較，對照病毒組和AdhTK1組均明顯增多（P＜0.01；P＜0.05）；但經(jīng)Ad-h TK1干預后大鼠的心肌膠原容積分數(shù)明顯低于對照病毒組（P＜0.05），見圖4。

圖4 Ad-hTK1干預大鼠心肌梗死后的左心室心肌膠原纖維沉積分布的比較苦味酸-天狼猩紅染色×100Fig.4 Collagen density of rat myocardium in three groups post-MI 4 weeks by Ad-hTK1 delivery Sirius red-saturated picric staining× 100

2.5 大鼠心肌梗死周圍區(qū)新生血管情況

光鏡下，各組CD34抗體和FITC標記的新生毛細血管為點狀黃綠色染色，陽性區(qū)域主要分布于心肌細胞質(zhì)，對照病毒組陽性染色明顯減少，Ad-hTK1組明顯增多，但比假手術組顯著減少，見圖5。新生血管密度（MVD）分析：對照病毒組大鼠心肌MVD明顯低于假手術組（P＜0.01），經(jīng)Ad-h TK1干預4周后，MVD顯著高于對照病毒（P＜0.05）。

圖5 Ad-hTK1干預后的大鼠心梗及周邊區(qū)新生血管分布情況CD34單抗的FITC標記免疫組化×100Fig.5 Angiogenesis in the myocardium post-MI 4 weeks by Ad-hTK1 delivery Histological analysis of CD34-FITC×100

3 討論

心室重塑是導致AMI后心力衰竭的重要病理機制。近年來具有細胞保護或特殊“功能獲得”效果的基因，使其過表達，治療心肌梗死后或心力衰竭的心肌重塑模型，已成為研究的焦點［13］。在本研究中，心梗大鼠模型干預4周后的心肌組織冰凍切片和蛋白免疫印跡法均觀察到綠色熒光蛋白和hTK1蛋白呈高表達，證實我們構建重組腺病毒載體系統(tǒng)在心肌組織中存在高表達。這與以往在大鼠血管平滑肌細胞和球囊拉傷頸總動脈的實驗，含重組腺病毒含hTK1基因cDNA已成功轉染并獲得高表達的研究相一致［9～11］。

急性心肌梗死后的心室重構，指急性心肌梗塞后左心室梗死區(qū)和非梗死區(qū)結構及形態(tài)的改變，根據(jù)其發(fā)生時間及演變，可分為梗塞區(qū)伸展和左心室擴張。梗死區(qū)伸展指梗死區(qū)不成比例地拉長、變薄，使局部室壁變形，心室腔擴大，但無新的心肌壞死。一般在急性心肌梗死后數(shù)小時內(nèi)即開始，2～3周內(nèi)結束。而左心室擴張，是由梗死區(qū)伸展和非梗死區(qū)被拉長而致左心室腔形態(tài)改變和整個左心室增大及質(zhì)量增加，主要表現(xiàn)為左室收縮末容積和舒張末容積增加，以及左室形態(tài)的改變［14］。本研究結果顯示，對照病毒組大鼠的心臟質(zhì)量、左室質(zhì)量、左室質(zhì)量指數(shù)都明顯高于假手術組；從心肌HE染色和天然猩紅染色結果可知，對照病毒組的梗死區(qū)肌纖維排列稀疏紊亂，肌絲斷裂，細胞核固縮、碎裂，包漿減少或缺失，間質(zhì)充血水腫和大量炎性細胞浸潤，細胞間隙連接消失，膠原纖維明顯增多，心肌膠原容積分數(shù)明顯大于假手術組，結果提示，心梗4周后的大鼠心肌已表現(xiàn)心肌重塑的改變。

本研究發(fā)現(xiàn)，hTK1基因過表達干預4周后SD大鼠的心臟質(zhì)量、左室質(zhì)量、左室質(zhì)量指數(shù)減輕，心肌結構改變明顯減輕，心肌纖維排列較整齊，膠原纖維減少和心肌間質(zhì)水腫減輕，少量炎癥細胞浸潤，提示TK1基因過表達可減少膠原纖維合成，減輕心肌纖維，從而改善心肌重塑。另有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌缺血再灌注的模型中，直接灌注緩激肽蛋白，可縮小心梗面積［15］。Silva等［16］在異丙腎上腺素誘導大鼠心梗模型中研究也發(fā)現(xiàn)，TK1基因過表達可明顯減輕心肌肥厚和纖維化，緩激肽受體阻斷劑可阻斷這種保護效應。提示TK1在心梗及周邊區(qū)過表達，可減少炎性反應及改善心梗后的纖維化作用，但具體機制尚未明了。

以往研究發(fā)現(xiàn)，注射含hTK1基因的腺病毒可改善1型糖尿病大鼠下肢缺血恢復［17］，局部注射激肽釋放酶或激肽蛋白，可促進缺血下肢血管生成［18］。本研究在TK1病毒組大鼠的梗死區(qū)域附近新生微血管內(nèi)皮細胞上有綠色熒光的陽性表達明顯增加，提示新生微血管密度增多，TK1基因過表達在心肌內(nèi)特定微環(huán)境下可促進新生血管形成。心肌梗死后的左心室需要更多氧和營養(yǎng)物質(zhì)，此時重塑后的心肌新生血管密度增加顯得尤為重要。AMI后心肌細胞丟失導致壓力負荷增加，多種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，尤其是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）被激活，產(chǎn)生大量的血管緊張素Ⅱ（AngⅡ），可誘導心肌細胞肥大和膠原纖維組織改變。許多證據(jù)表明，血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）在心血管系統(tǒng)中的保護效應，與其抑制緩激肽降解呈密切相關，因為緩激肽受體阻斷劑可消除心梗后ACEI逆轉心肌重塑的保護效應［19，20］。緩激肽是AngⅡ的功能拮抗劑，在體外實驗緩激肽可預防AngⅡ誘導的心肌細胞肥厚［21］。另外在受體水平，AT1R和緩激肽B2R兩者形成穩(wěn)定的異性二聚體，緩激肽又可通過B2R對AngⅡ-AT1R的拮抗作用，降低了AngⅡ?qū)π难苤貥嫷拇龠M作用。結合以往研究結果，TK1基因過表達可能通過心臟局部KKS系統(tǒng)自分泌或旁分泌功能，增加緩激肽水平。TK1增加心臟毛細血管密度可能是通過緩激肽-NO途徑來抑制內(nèi)皮細胞凋亡，促進心梗后心肌中的新生血管生成，提高內(nèi)皮細胞功能，減少心肌重塑。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，重組腺病毒介導的TK1基因過表達可減少炎性細胞，減少心肌膠原纖維，促進梗死區(qū)周圍組織的新生血管形成，可能與hTK1基因轉移后通過心臟局部KKS系統(tǒng)自分泌或旁分泌功能，增加緩激肽水平，增加心臟新生血管密度，從而改善大鼠心肌梗死后的心肌重塑。

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（編輯 裘孝琦）

Human Tissue Kallikrein Improves Ventricular Remodeling in Ratwith MyocardialInfarction

YUHui-zhen，ZHUPeng-li，HUANGShu-jie，XIANGHong，PANWei，ZHANGFeng，LINFan
（Department of Geriatrics，F(xiàn)ujian Provincial Hospital Key Laboratory of Geriatrics，F(xiàn)ujian Provincial Clinical College，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)ujian Institute of ClinicalGeriatrics，F(xiàn)uzhou 350001，China）

ObjectiveTo explore the effect of recombinant adenovirus-mediated human tissue kallikrein-1（Ad-hTK1）on ventricular remodeling in rats after myocardial infarction（MI）.MethodsRats were subjected to ligating left anterior descending artery of coronary artery.1×1010PFU AdhTK1 or control virus（Ad-EGFP）were administrated at multiple sites into the infarcted myocardium 1 h after the operation.Four weeks after the intervention，the protein expression of hTK1 was evaluated by Western blot analysis.Expression of the EGFP in MI was detected by fluorescence microscopy.Histological morphometric observation was carried out using fluorescence microscope and HE staining.Collagen were determined by Sirius red-saturated picric staining，and the number of myocardial microvessel was detected by CD34-FITC antibody immunocytochemistry assay.ResultsThe expression of green fluorescence and hTK1 protein were observed in Ad-hTK1 rats.There were no differences in body weight among different groups at 4 weeks after MI.As compared with sham group，MI resulted in increases in heart weight，LVW and LVWI，inflammation cells and collagen density，in decreases capillary density，at 4 weeks after MI.However，hTK1 gene delivery tended to reduce heart weight，LVW，LVWI，inflammation cells and collagen density at 4 weeks after MI.Capillary density in MI-hTK1 rats was also significantly increased than in the MI with control virus.ConclusionThis study indicates that recombinant adenovirus-mediated human tissue kallikrein-1 overexpression plays an important role in preventing the progression ofMIby attenuating cardiac hypertrophy and fibrosis，and improving neovascularization.

human tissue kallikrein 1；adenovirus；myocardial infarction；ventricular remodeling

R541.4

A

0258-4646（2014）09-0830-06

福建省自然科學基金（2011J01134；2010J01127）；福建省衛(wèi)生廳青年骨干培養(yǎng)人才項目（2013-ZQN-ZD-2）

余惠珍（1968-），女，副主任醫(yī)師，博士.

朱鵬立，E-mail：zpl7755@126.com

2014-07-02

網(wǎng)絡出版時間：