張秀偉，郝鳳霞，賀佳妮，謝玲玲，付琳，董千澤，李慶昌

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬第四醫(yī)院病理科，沈陽110032；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，沈陽110001）

染色質(zhì)重塑因子1在肺癌中過表達并促進肺癌增殖能力

張秀偉1，2，郝鳳霞2，賀佳妮2，謝玲玲2，付琳2，董千澤2，李慶昌2

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬第四醫(yī)院病理科，沈陽110032；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，沈陽110001）

目的檢測染色質(zhì)重塑因子1（Rsf-1）對肺癌增殖能力的影響，初步探討Rsf-1促進肺癌增殖的分子機制。方法應(yīng)用Western blot方法篩選Rsf-1高表達人肺癌H1299、H460細胞系，通過小干擾RNA（siRNA）方法干擾內(nèi)源性Rsf-1表達，并檢測干擾效率。應(yīng)用集落形成、流式細胞術(shù)檢測Rsf-1干擾前后肺癌細胞增殖能力的變化。應(yīng)用Western blot檢測干擾內(nèi)源性Rsf-1表達前后肺癌細胞中增殖相關(guān)因子的變化。結(jié)果Western blot結(jié)果顯示：肺癌細胞中Rsf-1蛋白表達水平明顯高于正常支氣管上皮HBE細胞系，其中H1299、H460細胞中存在非常明顯的Rsf-1高表達。轉(zhuǎn)染Rsf-1特異的siRNA于高表達Rsf-1的H1299和H460細胞后，其克隆形成明顯少于對照組（H1299細胞中對照組和干擾組分別為123±15和83±9；H460細胞中對照組和干擾組分別為218±18和112±17）（P＜0.05）。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示：干擾內(nèi)源性Rsf-1表達后，H1299和H460細胞中G1期細胞比例增多（H1299細胞中對照組和干擾組分別為56%±5%和71%±7%；H460細胞中對照組和干擾組分別為53%±4%和70%±6%），S期細胞比例減少（H1299細胞中對照組和干擾組分別為17%±2%和11%±5%；H460細胞中對照組和干擾組分別為19%±2%和10%±5%）。細胞周期相關(guān)蛋白檢測結(jié)果：干擾內(nèi)源性Rsf-1表達后，H1299和H460細胞中cyclinD1和磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（pERK）水平明顯下調(diào)。干擾Rsf-1在下調(diào)H1299和H460細胞pERK蛋白表達的作用結(jié)果與應(yīng)用細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）抑制劑U0126相似。結(jié)論Rsf-1可通過cyclinD1/ERK相關(guān)通路促進肺癌細胞的增殖。

染色質(zhì)重塑因子1；肺癌；小干擾RNA；磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶；cyclinD1

在染色體11q13.5區(qū)域的眾多基因中，染色質(zhì)重塑因子1（remodeling and spacing factor-1，Rsf-1）越來越受到關(guān)注。研究顯示，Rsf-1在卵巢癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中存在過表達和（或）基因擴增，且與腫瘤細胞的惡性程度、增殖能力及患者預(yù)后等顯著相關(guān)。我們之前的研究表明，Rsf-1在肺癌中也存在蛋白過表達和mRNA水平上調(diào)。雖然有文獻報道Rsf-1蛋白與hSNF2H形成復(fù)合體后可引起細胞增殖，但引起哪些與增殖有關(guān)的因子改變和機制尚不清楚。本研究應(yīng)用Western blot方法篩選出Rsf-1高表達的肺癌細胞系，采用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）等方法，分析Rsf-1對肺癌細胞增殖的影響，探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與siRNA干擾

人肺癌H1299、A549、SPC、H157、LK2、H460細胞系及正常人支氣管上皮細胞HBE細胞系均購自上海中科院細胞庫，用含10%熱滅活新鮮小牛血清的DMEM（美國Gibco公司）、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。Rsf-1特異性干擾序列為GGAAAGACAUCUCU ACUAUUU（L-020374-01-0005），陰性對照組亂序?qū)φ誷iRNA序列為GAAGCAACGUAUCUUGA#1（D-001810-01-05），干擾Rsf-1siRNA以及亂序?qū)φ誷iRNA購自美國Dharmacon公司，采用DharmaFECT 1（美國Thermo Fisher Scientific公司）依說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染，并驗證干擾效果。

1.2 Western blot檢測蛋白表達

收集細胞加入裂解液充分裂解，低溫高速離心（4℃，12 000 r/min，30 min），提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60 μg。電泳（12%SDS-PAGE凝膠）、5%正常小牛血清封閉，抗Rsf-1（1∶1 000，美國Upstate公司）、cyclinD1、cyclinE、CDK4/6、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular-regulated protein kinase，ERK）、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylation of extracellular-regulated protein kinase，pERK）（1∶1 000，美國Cell Signaling公司）和抗β-actin（1∶500，北京中杉），4℃孵育過夜，分別與各自對應(yīng)的二抗（1∶2 500，美國Santa Cruz公司）室溫孵育2 h，ECL（美國Millopore公司）顯色，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀（Chemi Imager 5500，美國Alpha Innotech公司）采集。

1.3 實時PCR（SYBR Green法）

收集轉(zhuǎn)染干擾Rsf-1及對照siRNA的H1299和H460細胞，使用Trizol提取RNA，用實時PCR驗證干擾效率，Rsf-1引物序列：正義：5′-GATACTATGCG TCTCCAGCCAA-3′，反義：5′-CAACTCGTTTCGATT TCTGACAA-3′。Rsf-1mRNA表達水平的相對定量分析采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，以β-actin基因為內(nèi)參，在ABI 7900型實時定量PCR儀上進行檢測。β-actin正義：5′-ATAGCACAGCCTGGATAGC AACGTAC-3′，反義：5′-CACCTTCTACAATGAGCTG CGTGTG-3′。

1.4 集落形成試驗

轉(zhuǎn)染干擾Rsf-1及對照siRNA后24 h，將細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，進行細胞計數(shù)，將500個細胞種植于直徑3 cm培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)1周后終止培養(yǎng)，甲醇固定，Giemsa染色，鏡下計數(shù)超過50個細胞的集落。

1.5 細胞周期檢測

將大約50%密度的H1299和H460細胞鋪到6孔板中，轉(zhuǎn)染干擾Rsf-1及對照siRNA，先饑餓24 h，達到同步化后再換含10%胎牛血清培養(yǎng)24 h后收集細胞，離心，PBS清洗，加入75%乙醇4℃固定4 h，離心，PBS清洗，加入碘化丙錠，室溫避光30 min后上機檢測細胞周期。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rsf-1在肺癌細胞中過表達

采用Western blot篩選人肺癌H1299、A549、SPC、H157、LK2、H460細胞系及正常人支氣管上皮細胞HBE細胞系后發(fā)現(xiàn)，H1299、H460和SPC這3種肺癌細胞中Rsf-1的蛋白表達水平明顯高于正常的HBE細胞系，其中在H1299和H460細胞中存在非常明顯的Rsf-1高表達（圖1A）。采用實時PCR驗證干擾效率，結(jié)果轉(zhuǎn)染干擾Rsf-1特異siRNA的H1299和H460細胞其Rsf-1mRNA含量比對照組細胞明顯下降（P＜0.05）（圖1B）。

2.2 干擾Rsf-1表達下調(diào)肺癌細胞的增殖能力

轉(zhuǎn)染干擾Rsf-1及對照siRNA于H1299和H460細胞，將轉(zhuǎn)染48 h后的細胞進行集落接種，1周后計數(shù)克隆形成情況，干擾Rsf-1組的H1299和H460細胞的集落形成明顯少于對照組（圖2）。H1299細胞中對照組和干擾組分別為123±15和83±9，H460細胞中對照組和干擾組分別為218±18和112±17，均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

2.3Rsf-1通過cyclinD1/ERK影響肺癌細胞增殖

干擾Rsf-1的表達后，G1期細胞的比例增多，H1299細胞中對照組和干擾組分別為56%±5%和71%±7%，H460細胞中對照組和干擾組分別為53%±4%和70%±6%；S期細胞比例減少，H1299細胞中對照組和干擾組分別為17%±2%和11%±5%，H460細胞中對照組和干擾組分別為19%±2%和10%±5%（圖3），提示Rsf-1可能通過細胞周期調(diào)控來影響肺癌細胞的增殖能力。我們檢測了一系列與細胞周期相關(guān)的蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)干擾Rsf-1后，細胞cyclinD1的水平明顯下調(diào)，同時pERK水平明顯下調(diào)（圖4）。Western blot結(jié)果顯示，干擾Rsf-1下調(diào)pERK的蛋白表達水平與應(yīng)用抑制劑U0126的結(jié)果相似，均明顯低于對照組（圖5），這個結(jié)果提示Rsf-1可能通過ERK相關(guān)通路影響肺癌細胞的增殖能力。

圖1 Rsf-1在肺癌細胞系中的表達及其干擾效率Fig.1 Rsf-1 expression in lung cancer cell lines

圖2 干擾Rsf-1明顯抑制肺癌細胞增殖能力Fig.2 Colony formation assay result showed that Rsf-1 knockdown inhibited cell proliferation

圖3 干擾Rsf-l抑制肺癌細胞G1～S期進展Fig.3 Depletion of Rsf-1 inhibited cell cycle progression

圖4 干擾Rsf-1下調(diào)cyclinD1和pERK水平Fig.4 Rsf-1 knockdown decreased cyclinD1 expression and ERK in both cell lines

圖5 干擾Rsf-1與應(yīng)用ERK抑制劑U0126一樣下調(diào)肺癌細胞pERK水平Fig.5 Rsf-1 knockdown had the same effect with U0126 in the aspect of decrease the levels of pERK in both cell lines

3 討論

Rsf-1位于11q13.5，是在Hela細胞核中發(fā)現(xiàn)的新基因［1］。染色體區(qū)域11q13是在人體腫瘤中最常見的擴增區(qū)域之一［2～8］，該區(qū)域的某些基因擴增存在于卵巢癌、乳腺癌、食管癌、口腔鱗癌等上皮性惡性腫瘤中，這些基因包括Rsf-1、EMSY、PAK1、TAOS1、Rad9、CCND1、FGF3與FGF4等。研究顯示，存在于11q13.5區(qū)域的Rsf-1基因在卵巢癌與乳腺癌等多種惡性腫瘤中存在明顯擴增，并且具有促進腫瘤細胞增殖的能力［2，9，10］。有研究表明Rsf-1促進腫瘤細胞增殖的作用依賴于其能夠與hSNF2H蛋白形成RSF復(fù)合體［11］。Shih等［8，11］報道Rsf-1參與調(diào)控核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）和ERK信號通路的幾個相關(guān)基因表達的改變，從而與腫瘤細胞惡性生物學(xué)行為相關(guān)。結(jié)腸癌研究中Rsf-1可通過調(diào)控cyclinE和pRb促進腫瘤生長［12］。新近的研究顯示，Rsf-1可以通過與cyclinE結(jié)合從而促進卵巢癌細胞增殖［13］。但到目前為止Rsf-1在肺癌中對腫瘤惡性生物學(xué)行為的影響及機制尚待闡明。

我們之前的研究表明，Rsf-1在肺癌中也存在過表達，提示其與肺癌惡性程度存在一定關(guān)系。為了研究Rsf-1在肺癌中對腫瘤增殖能力的影響及作用機制，我們通過Western blot方法篩選出Rsf-1高表達的肺癌細胞系H1299、H460。應(yīng)用Rsf-1特異siRNA瞬時轉(zhuǎn)染干擾內(nèi)源性Rsf-1表達后，發(fā)現(xiàn)肺癌細胞克隆形成率明顯減少。同時應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測干擾Rsf-1基因后細胞周期的改變，發(fā)現(xiàn)H1299和H460細胞中G1期細胞增多、S期細胞減少，細胞G1～S期過渡受到明顯抑制，提示Rsf-1可能調(diào)控了與肺癌細胞生長和增殖相關(guān)的某些基因的改變。眾所周知，cyclinD1是G1～S期過渡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它能與CDK4/6形成復(fù)合體，在許多腫瘤中呈現(xiàn)出過表達共同調(diào)控細胞周期［14］。研究表明，活化的ERK通過激活轉(zhuǎn)錄因子，增強cyclinD1基因的表達，從而促進細胞惡性增殖，ERK為cyclinD1表達的上游分子。cyclinD1的轉(zhuǎn)錄是依賴于ERK信號傳導(dǎo)通路的持續(xù)激活和滯留于細胞核內(nèi)完成的［15］。為了驗證Rsf-1促進肺癌細胞增殖的作用是否也依賴cyclinD1/ERK相關(guān)通路，我們檢測了一系列與細胞周期相關(guān)的蛋白表達情況。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在H1299、H460細胞中干擾Rsf-1組與對照組相比cyclinD1蛋白表達水平均下調(diào)；CDK4/6在H1299細胞中沒有明顯變化，只有CDK4在H460細胞中出現(xiàn)下調(diào)。表明Rsf-1基因具有調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白表達的功能，并且主要影響的是G1期進程。有報道Rsf-1參與調(diào)控NF-κB和ERK信號通路中幾個相關(guān)基因的表達，同時RAF-MEK-ERK通路在惡性腫瘤中起著至關(guān)重要的作用［16］。因此我們也檢測了ERK和pERK，發(fā)現(xiàn)干擾Rsf-1基因表達后在兩種細胞中pERK蛋白表達水平均出現(xiàn)一定程度的下調(diào)。在此基礎(chǔ)上我們發(fā)現(xiàn)，干擾Rsf-1在下調(diào)pERK蛋白表達中的作用與應(yīng)用ERK抑制劑U0126相似。上述結(jié)果說明Rsf-1具有調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白表達的功能，并且主要影響的是G1期進程。同時也表明Rsf-1不僅通過細胞周期，還可通過ERK等多種其他途徑發(fā)揮調(diào)控細胞增殖的作用。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)Rsf-1能夠促進肺癌增殖；Rsf-l通過cyclinD1/ERK相關(guān)通路調(diào)節(jié)肺癌細胞的增殖能力。這些結(jié)果豐富了Rsf-1促進腫瘤的可能機制，使其可能成為治療肺癌的新靶點。

［1］LeRoy G，Orphanides G，Lane WS，et al.Requirement of RSF and FACT for transcription of chromatin templates in vitro［J］.Science，1998，282（5395）：1900-1904.

［2］Shih IeM，Sheu JJ，Santillan A，et al.Amplification of a chromatin remodeling gene，Rsf-1/HBXAP，in ovarian carcinoma［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（39）：14004-14009.

［3］Brown LA，Irving J，Parker R，et al.Amplification of EMSY，a novel oncogene on 11q13，in high grade ovarian surface epithelial carcinomas［J］.Gynecol，2006，100（2）：264-270.

［4］Hennessy BT，Nanjundan M，Cheng KW，et al.Identification of remodeling and spacing factor 1（rsf-1，HBXAP）at chromosome 11q13 as a putative oncogene in ovarian cancer［J］.Eur J Hum Genet，2006，14（4）：381-383.

［5］Bostner J，Ahnstrom Waltersson M，F(xiàn)ornander T，et al.Amplification of CCND1 and PAK1 as predictors of recurrence and tamoxifen resistance in postmenopausal breast cancer［J］.Oncogene，2007，26（49）：6997-7005.

［6］Rosen A，Sevelda P，Klein M，et al.First experience with FGF-3（INT-2）amplification in women with epithelial ovarian cancer［J］. Br J Cancer，1993，67（5）：1122-1125.

［7］Cheng CK，Chow LW，Loo WT，et al.The cell cycle checkpoint gene Rad9 is a novel oncogene activated by 11q13 amplification and DNA methylation in breast cancer［J］.Cancer Res，2005，65（19）：8646-8654.

［8］Choi JH，Sheu JJ，Guan B，et al.Functional analysis of 11q13.5 amplicon identifies Rsf-1（HBXAP）as a gene involved in paclitaxel resistance in ovarian cancer［J］.Cancer Res，2009，69（4）：1407-1415.

［9］Davidson B，Trope CG，Wang TL，et al.Expression of the chromatinremodeling factor Rsf-1 is upregulated in ovarian carcinoma effusions and predicts poor survival［J］.Gynecol Oncol，2006，103（3）：814-819.

［10］Fang FM，Li CF，Huang HY，et al.Overexpression of a chromatin remodeling factor，RSF-1/HBXAP，correlates with aggressive oral squamous cell carcinoma［J］.Am J Pathol，2011，178（5）：2407-2415.

［11］Shibata T，Uryu S，Kokubu A，et al.Genetic classification of lung adenocarcinoma based on array-based comparative genomic hybridization analysis：its association with clinicopathologic features［J］.Clin Cancer Res，2005，11（17）：6177-6185.

［12］Liu S，Dong Q，Wang E.Rsf-1 overexpression correlates with poor prognosis and cell proliferation in colon cancer［J］.Tumour Biol， 2012，33（5）：1485-1491.

［13］Sheu JJ，Choi JH，Guan B，et al.Rsf-1，a chromatin remodelling protein，interacts with cyclin E1 and promotes tumour development［J］.J Pathol，2013，229（4）：559-568.

［14］Kim JK，Diehl JA.Nuclear cyclin D1：an oncogenic driver in human cancer［J］.J Cell Physiol，2009，220（2）：292-296.

［15］Ravenhall C，Guida E，Harris T，et al.The importance of ERK activity in the regulation of cyclin D1 levels and DNA synthesis in human cultured airway smooth muscle［J］.Br J Pharmacol，2000，131（1）：17-28.

［16］Montagut C，Settleman J.Targeting the RAF-MEK-ERK pathway in cancer therapy［J］.Cancer Lett，2009，283（2）：125-134.

（編輯 陳姜）

Remodeling and Spacing Factor1 is Overexpressed and Promotesthe Tumor CellProliferation in Lung Cancer

ZHANGXiu-wei1，2，HAO Feng-xia2，HEJia-ni2，XIELing-ling2，F(xiàn)ULin2，DONG Qian-ze2，LIQing-chang2
（1.DepartmentofPathology，The Fourth Affiliated Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110032，China；2.DepartmentofPathology，College ofBasic Medical Science，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the relationship between remodeling and spacing factor 1（Rsf-1）expression and tumor cell proliferation in lung cancers.MethodsSmall interfering RNA（siRNA）was used to knockdown the high endogenousRsf-1expression in H1299 and H460 cell lines. Colony formation assays and flow cytometry were employed to detect the change of cell proliferation ability of H1299 and H460 cells.The expression of proliferation related factor changes after interference was evaluate by Western blot.ResultsKnockdown of Rsf-1 expression in H1299 and H460 cells resulted in a decrease of clone formation ability（H1299 control vs siRNA：123±15 vs 83±9；H460 control vs siRNA：218±18 vs 112±17，P＜0.05）.Rsf-1knockdown induced cell cycle arrest at the G1/S boundary to inhibit cell proliferation，G1phase cells（H1299 control vs siRNA：56%± 5%vs 71%±7%；H460 control vs siRNA：53%±4%vs 70%±6%），S phase cells（H1299 control vs siRNA：17%±2%vs 11%±5%；H460 control vs siRNA：19%±2%vs 10%±5%）（P＜0.05）.Western blot results revealed that knockdown ofRsf-1decreased cyclinD1 and phosphorylation of extracellular-regulated protein kinase（pERK）protein level in both cell lines.At the same time，Rsf-1knockdown showed the same effect with U0126 in down-regulating the levelsofpERKin both celllines.ConclusionRsf-1 contributes to malignantcellgrowth by modulatingcyclinD1expression andERKactivity，which makesRsf-1a potentialtherapeutic targetin lung cancer.

remodeling and spacing factor 1；lung cancer；small interfering RNA；phosphorylation of extracellular-regulated protein kinase；cyclinD1

R734.2

A

0258-4646（2014）09-0821-05

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（20132104110025）

張秀偉（1973-），女，主治醫(yī)師，博士研究生.

李慶昌，E-mail：liqingch@hotmail.com

2014-06-17

網(wǎng)絡(luò)出版時間：