王波，汲坤，張麗艷，尚德志，侯君妍，華正偉

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院病理科，內(nèi)蒙古民族大學(xué)分子病理學(xué)研究所，內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古牙克石022150；2.沈陽醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽110034；3.沈陽醫(yī)學(xué)院頜面外科，沈陽110034；4.沈陽醫(yī)學(xué)院2011級口腔醫(yī)學(xué)，沈陽110034）

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78和基質(zhì)金屬蛋白酶在口腔鱗狀細胞癌中的表達

王波1，汲坤2，張麗艷2，尚德志3，侯君妍4，華正偉4

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院病理科，內(nèi)蒙古民族大學(xué)分子病理學(xué)研究所，內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古牙克石022150；2.沈陽醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽110034；3.沈陽醫(yī)學(xué)院頜面外科，沈陽110034；4.沈陽醫(yī)學(xué)院2011級口腔醫(yī)學(xué)，沈陽110034）

目的探討葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達及意義，闡明GRP78在口腔鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測26例口腔鱗狀細胞癌組織和10例正?？谇唤M織中GRP78蛋白的表達；采用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測正常口腔組織和口腔鱗狀細胞癌組織中GRP78mRNA的表達；采用免疫組織化學(xué)方法檢測26例口腔鱗狀細胞癌組織中MMP-2和MMP-9蛋白的表達。結(jié)果GRP78蛋白在口腔鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率為100%（26/26），在正?？谇唤M織中的陽性表達率為20%（2/10），兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與高分化和中分化口腔鱗狀細胞癌組織比較，低分化口腔鱗狀細胞癌組織中的GRP78蛋白陽性表達強度明顯增高（P＜0.05）。與正常口腔組織比較，GRP78mRNA表達水平在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達增高（P＜0.05）。MMP-2和MMP-9蛋白在口腔鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率均為100%（26/26）。結(jié)論GRP78和MMPs在口腔鱗狀細胞癌組織中表達明顯升高，提示口腔鱗狀細胞癌中GRP78蛋白的表達可能與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

口腔鱗狀細胞癌；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；基質(zhì)金屬蛋白酶

口腔癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率約占全身惡性腫瘤的3%左右［1］，其中90%為鱗狀細胞癌。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成、分泌的一種蛋白質(zhì)，屬于熱休克蛋白70家族。近年來隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)GRP78除了駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中起到分子伴侶的作用外，還可以轉(zhuǎn)運至細胞膜、細胞質(zhì)，甚至分泌到細胞外，參與細胞分化、細胞生存、血管形成等重要生物學(xué)過程的調(diào)控，是一種多功能的蛋白質(zhì)［2］。GRP78在正常成人腦、肺臟、心臟器官有基礎(chǔ)水平的低表達［3］，在腫瘤組織中卻高表達。有研究表明，GRP78與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。然而有關(guān)口腔鱗狀細胞癌中GRP78的表達及其與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達關(guān)系的研究尚未見報道。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測口腔鱗狀細胞癌組織中GRP78及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2和MMP-9蛋白的表達，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）方法檢測口腔鱗狀細胞癌組織中GRP78的表達，闡明GRP78與口腔鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

標本資料：26例口腔鱗狀細胞癌石蠟標本和10例正?？谇唤M織石蠟標本。26例口腔鱗狀細胞癌組織為2008年1月至2013年12月內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院收治的口腔鱗狀細胞癌患者的癌組織標本，10例正常口腔組織取自活檢組織，組織切片均經(jīng)病理學(xué)證實。其中男性26例，女性10例，年齡48～79歲，平均年齡63歲。26例口腔鱗狀細胞癌組織標本按照腫瘤病理學(xué)分類標準進行診斷并分級：高分化10例，中分化8例，低分化8例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)：組織標本常規(guī)10%甲醛固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，浸入二甲苯透明，常規(guī)浸蠟，包埋，切片，行免疫組織化學(xué)染色。兔抗人GRP78、MMP-2和MMP-9抗體購自中國BOSTER，羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗和DAB顯色劑購自美國Santa Cruz公司。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司。顯微鏡下觀察口腔組織細胞質(zhì)中GRP78、MMP-2和MMP-9的表達情況，根據(jù)細胞內(nèi)棕染顆粒多少和染色的強弱，將表達強度分為不表達（-）、弱陽性表達（+）及強陽性表達（++）。判定方法如下：每張切片隨機選取10個高倍視野。按著色面積百分數(shù)計分：0分，＜10%；1分，10%～40%；2分，40%～70%；3分，＞70%。按著色強度計分：0分，無著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色。兩者相乘：0分，為陰性（-）；1～3分，為弱陽性（+）；4分以上，為強陽性（++）。

1.2.2 RT-PCR：取液氮中保存的正?？谇唤M織和口腔鱗狀細胞癌組織各50 mg，勻漿，按總RNA提取按試劑盒說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，分別用GRP78及GAPDH的引物進行PCR擴增，30個循環(huán)后取PCR產(chǎn)物進行電泳，采用天能凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度，實驗重復(fù)3次。GAPDH引物序列如下：上游引物5′-GGTGATGCTGGTG CTGAGTATGT-3′，下游引物5′-AAGAATGGGAGTT GCTGTTGAAGTC-3′，擴增片段長度617 bp。GRP78引物序列如下：上游引物5′-GATAATCAACC AACTGTTAC-3′，下游引物5′-GTATCCTCTTCACCA GTTGG-3′，擴增片段長度578 bp。引物上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，口腔鱗狀細胞癌組織與正?？谇唤M織GRP78和MMPs表達比較采用Fisher′s Exact檢驗，口腔鱗狀細胞癌組織與正?？谇唤M織GRP78mRNA表達比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GRP78蛋白在口腔鱗狀細胞癌組織和正?？谇唤M織中的表達

通過對36例口腔組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析，我們發(fā)現(xiàn)GRP78蛋白表達于細胞質(zhì)中，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。GRP78蛋白在10例正?？谇唤M織中陽性表達率為20%（2/10），在26例口腔鱗狀細胞癌組織中均成陽性表達，陽性表達率為100%（26/26），見圖1?？谇击[狀細胞癌組織與正?？谇唤M織比較GRP78陽性表達率有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。

圖1 正?？谇唤M織和口腔鱗狀細胞癌組織中GRP78的表達×40Fig.1 Immunohistochemical analysis of GRP78 expression in normal oral tissue and oral squamous cell carcinoma tissues×40

2.2 不同病理分級的口腔鱗狀細胞癌中GRP78的表達水平

口腔鱗狀細胞癌病理分級為高分化的病例中GRP78強陽性表達率為30%（3/10），中分化病例為50%（4/8），低分化病例為87.5%（7/8）。各病理分級間GRP78強陽性表達率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示GRP78的表達與口腔鱗狀細胞癌的病理分級有關(guān)，其表達隨著病理分級的增加而下降。

2.3 正?？谇唤M織和口腔鱗狀細胞癌組織中GRP78mRNA的表達

RT-PCR結(jié)果顯示，與正?？谇唤M織（0.33± 0.025）比較，高分化（0.68±0.017）、中分化（0.79± 0.026）、低分化（0.99±0.013）口腔鱗狀細胞癌組織中GRP78mRNA表達量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與高分化、中分化口腔鱗狀細胞癌組織比較，低分化口腔鱗狀細胞癌組織中GRP78mRNA表達量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 半定量RT-PCR檢測口腔鱗狀細胞癌組織中GRP78 mRNA的表達水平Fig.2 Semi-quantitative RT-PCR analysis of GRP78 mRNA in normal oral tissue and oral squamous cell carcinoma tissue

2.4 腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2蛋白在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達

通過對26例口腔鱗狀細胞癌組織MMP-2蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)MMP-2蛋白表達于細胞質(zhì)中，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。MMP-2蛋白在口腔鱗狀細胞癌組織中均成陽性表達，陽性表達率為100%（26/26），見圖3。

圖3 口腔鱗狀細胞癌組織中MMP-2的表達×40Fig.3 Immunohistochemical analysis of MMP-2 expression in oral squamous cell carcinoma tissues×40

2.5 腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-9蛋白在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達

通過對26例口腔鱗狀細胞癌組織MMP-9蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)MMP-9蛋白表達于細胞質(zhì)中，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。MMP-9蛋白在口腔鱗狀細胞癌組織中均成陽性表達，陽性表達率為100%（26/26），見圖4。

圖4 口腔鱗狀細胞癌組織中MMP-9的表達×40Fig.4 Immunohistochemical analysis of MMP-9 expression in oral squamous cell carcinoma tissues×40

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，展開或錯誤折疊的蛋白質(zhì)在凋亡和癌變過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用［4］。分子伴侶蛋白GRP78是1977年在無葡萄糖介質(zhì)中培養(yǎng)雞胚成纖維細胞的過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種分子量為78 kDa的蛋白，又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，是熱休克蛋白70家族中高度保守的成員之一，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激［5］。人類GRP78基因定位在9號染色體q33-q34.1上，主要在細胞質(zhì)表達。在生理情況下，GRP78通過膜傳感器維持滅活狀態(tài)［6］。未折疊蛋白可使GRP78活化和觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)，GRP78由生理性應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生［7］，在胚胎發(fā)育期間表達［8］。在細胞周期早期，GRP78在胚胎細胞增殖和保護內(nèi)細胞團抵抗凋亡方面發(fā)揮重要作用［9］。GRP78過表達與多種人類腫瘤的侵襲相關(guān)，包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和胃癌等［10］。GRP78和腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)表現(xiàn)在GRP78在腫瘤的轉(zhuǎn)移細胞株和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的細胞株表達增加，敲除GRP78可以抑制腫瘤細胞的侵襲和腫瘤異種移植模型中腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［11］。在乳腺癌、肝癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和胃癌患者，GRP78表達增高與腫瘤病理級別、復(fù)發(fā)和患者生存質(zhì)量相關(guān)［12］。有研究表明GRP78通過PTEN和Akt信號通路參與了癌癥的發(fā)展和生存優(yōu)勢［13］。作為細胞膜蛋白的GRP78還通過MAPK/ PI3K和Smad2/3信號通路調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖和侵襲［14］。

本研究采用免疫組織化學(xué)方法對口腔鱗狀細胞癌組織和正?？谇唤M織中GRP78蛋白表達進行檢測，結(jié)果表明了GRP78蛋白在口腔鱗狀細胞癌組織中表達顯著升高，其表達強度與口腔鱗狀細胞癌的病理分級有關(guān)，隨著腫瘤病理分級的增加而下降。GRP78mRNA表達在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達也顯著高于正?？谇唤M織，且低分化的口腔鱗狀細胞癌組織中GRP78mRNA表達高于中分化和高分化口腔鱗狀細胞癌組織。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2和MMP-9蛋白在口腔鱗狀細胞癌組織中表達均成陽性。上述結(jié)果表明了GRP78和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2和MMP-9蛋白在口腔鱗狀細胞癌中均成陽性表達，提示GRP78蛋白可能在口腔鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。GRP78與口腔鱗狀細胞癌發(fā)展的具體機制尚未明確，我們在后期研究中將進一步證實。

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（編輯 陳姜）

Expression of Glucose Regulated Protein 78 and Matrix Metalloproteinasesin OralSquamous CellCarcinoma

WANGBo1，JIKun2，ZHANGLi-yan2，SHANGDe-zhi3，HOUJun-yan4，HUAZheng-wei4
（1.Department of Pathology，The Second Clinical Medical School of Inner Mongolia University for the Nationalities，Molecular Pathological Research Institute of Inner Mongolia University for Nationalities，Department of Pathology，Inner Mongolia Forestry General Hospital，Yakeshi 022150，China；2.Department of Pathophysiology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；3.Department of Maxillofacial Surgery，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；4.Grade 2011 OralMedicine，Shenyang MedicalCollege，Shenyang110034，China）

ObjectiveTo explore the expression and significance of glucose regulated protein 78（GRP78）and matrix metalloproteinases（MMPs）in human oralsquamous cellcarcinoma，and clarify the effectofGRP78in the process oforalsquamouscellcarcinoma.MethodsThe expression of GRP78，MMP-2 and MMP-9 were evaluated by immunohistochemistry in 26 oral squamous cell carcinoma tissues.RT-PCR was performed to detect the mRNA levels ofGRP78in oral squamous cell carcinoma tissues.ResultsThe results of immunohistochemistry indicated that the positive rates of GRP78 were 100%and 20%in oral squamous cell carcinoma tissues and normal oral tissues，and the difference was significant（P＜0.01）.Compared with well differentiated and moderately differentiated oral squamous cell carcinoma tissues，the positive rates of GRP78 protein in poorly differentiated oral squamous cell carcinoma tissues were obvious higher（P＜0.05）.Compared with normal oral tissues，the expression ofGRP78mRNA in oral squamous cell carcinoma tissues was significantly increased（P＜0.05）.Compared with well differentiated and moderately differentiated oral squamous cell carcinoma tissues，the expression ofGRP78mRNA in poorly differentiated was significantly increased（P＜0.05）. The positive expression of MMP-2 and MMP-9 were 100%in oral squamous cell carcinoma tissues.ConclusionThe expression ofGRP78and MMPs were obviously increased in oral squamous cell carcinoma tissue.The expression of GRP78 may plays an important role in the development and progression oforalsquamouscellcarcinoma.

oral squamous cell carcinoma；glucose regulated protein 78；matrix metallopreteinases

R739.8

A

0258-4646（2014）09-0786-04

國家自然科學(xué)基金（81260310）；遼寧省博士科研啟動基金（20111126）

王波（1976-），男，副主任醫(yī)師，博士.

汲坤，E-mail：jikun0629@gmail.com

2014-06-13

網(wǎng)絡(luò)出版時間：