馬勇+陳秀莉+劉曉光

摘要：以產(chǎn)油酵母突變菌株Y1m為試驗(yàn)菌株，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)突變菌株Y1m發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，該突變菌株最適發(fā)酵產(chǎn)脂條件為發(fā)酵時(shí)間5 d，100 mL搖瓶裝液量20 mL，發(fā)酵液初始pH 6.0，種子液接種量為10%，溫度27 ℃，產(chǎn)脂培養(yǎng)基中硫酸鋅含量為0.5 mg/L，氯化鈣含量為0.3 g/L，氯化鐵含量為0.5 mg/L，硫酸銅含量為0.05 mg/L時(shí)，突變菌株Y1m在上述條件下油脂產(chǎn)量最高。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)油酵母；產(chǎn)脂發(fā)酵；金屬離子；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TQ920.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）01-0025-03

Optimizing Fermentation Conditions for Oil Production from A Strain of Oleaginous Yeast with Shake Flask

MA Yong，CHEN Xiu-li，LIU Xiao-guang

（Department of Biological Sciences and Technology， Baotou Teachers College， Baotou 014030， Inner Mongolia， China）

Abstract： Using the oleaginous yeast mutant strain Y1m as material， conditions for its lipid fermentation were optimized with single factor experiment. The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows： 5 d， 20 mL volume of 100 mL shake flask， 100% seed inoculation of liquid，pH 6.0， 27 ℃， lipid fermentation with the concentration of ZnSO4， CaCl2， FeCl3， CuSO4 being 0.5 mg/L， 0.3 g/L， 0.5 mg/L， 0.05 mg/L， respectively.

Key words： oleaginous yeast； lipid fermentation； metal ion； optimization

收稿日期：2013-05-10

基金項(xiàng)目：包頭師范學(xué)院青年科學(xué)研究基金項(xiàng)目（BSYKJ2011-17）

作者簡(jiǎn)介：馬 勇（1980-），男，遼寧臺(tái)安人，實(shí)驗(yàn)師，在讀博士研究生，主要從事微生物油脂及植物生理與農(nóng)作物基因工程方面研究，（電話）

13684725880（電子信箱）besbandon@126.com；通訊作者，劉曉光（1963-），男，內(nèi)蒙古海拉爾人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物

組織生物學(xué)研究，（電子信箱）besbandon@126.com。

中國(guó)人均石化資源儲(chǔ)量十分有限，而能源需求量卻與日俱增。微生物油脂是石化能源替代品生物柴油的潛在油源。由微生物生產(chǎn)富含多種生理功能的不飽和脂肪酸油脂已引起國(guó)內(nèi)外的廣泛重視。因此，微生物油脂的研究與利用將成為新世紀(jì)油脂工業(yè)的一個(gè)發(fā)展方向[1-3]。微生物油脂又稱單細(xì)胞油脂，是由酵母、霉菌和細(xì)菌等微生物在一定的條件下利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭鳛樘荚?，在菌體內(nèi)產(chǎn)生的油脂[4]。自然界中一些產(chǎn)油微生物在碳源充足而其他營(yíng)養(yǎng)成分（通常為氮源）缺乏的情況下，可以在胞內(nèi)大量積累油脂，甚至達(dá)到自身干重的60%以上[5]。產(chǎn)油真菌積累油脂過(guò)程中可在胞內(nèi)形成一個(gè)或多個(gè)油脂顆粒[5-7]。與傳統(tǒng)油脂生產(chǎn)相比，微生物油脂生產(chǎn)具有許多優(yōu)點(diǎn)：能連續(xù)規(guī)?；a(chǎn)，周期短，所需原料豐富、價(jià)格便宜，并可利用工農(nóng)業(yè)廢棄物，不受季節(jié)、氣候變化限制，可利用細(xì)胞誘變、融合及基因工程等技術(shù)改良菌種等[1]。

本試驗(yàn)考察不同發(fā)酵條件、不同金屬離子對(duì)產(chǎn)油酵母突變菌株Y1m發(fā)酵產(chǎn)脂的影響，給產(chǎn)油酵母產(chǎn)脂發(fā)酵后期菌體內(nèi)油脂積累條件提供基本配方參考，以期為合理利用許多廉價(jià)原料及大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 產(chǎn)油酵母突變菌株Y1m由包頭師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院試驗(yàn)中心保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 麥芽汁培養(yǎng)基：糖度為10～12°Bé的麥芽汁，pH自然；液體種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，（NH4）2SO4 5，KH2PO4 1， 酵母粉0.5，MgSO4·7H2O 0.5；基礎(chǔ)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30，蛋白胨1.5，KH2PO4 2，MgSO4·7H2O 0.5，（NH4）2SO4 0.5，pH自然。

1.2 方法

將產(chǎn)油酵母突變菌株Y1m接種在12°Bé麥芽汁固體斜面培養(yǎng)基上，于28 ℃靜置活化培養(yǎng)72 h。

1.2.1 誘變后菌株種子液制備 將活化后的突變菌株Y1m接一環(huán)于液體種子培養(yǎng)基中，160 r/min、28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2 誘變后菌株的初始發(fā)酵 在發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中接種已培養(yǎng)24 h的液體種子，接種量10%，160 r/min、28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.3 菌體生物量測(cè)定 將上述發(fā)酵培養(yǎng)液振蕩均勻后，取50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液置于已知重量的100 mL離心管內(nèi)，5 000 r/min離心5 min收集菌體，用生理鹽水洗滌2～3次，再次5 000 r/min離心5 min收集菌體，棄上清后，將含有濕菌體的已知重量的離心管置于65 ℃下干燥至恒重，冷卻至室溫后準(zhǔn)確稱取離心管重量，以離心管前后重量的差值與發(fā)酵液體積的比值作為菌體生物量（mg/mL）。

1.2.4 油脂含量測(cè)定 每克干菌體加入4 mol/L HCl 6 mL，振蕩混勻，室溫下放置30 min后，沸水浴 3 min，-20 ℃速冷，加入10 mL氯仿與甲醇的混合試劑（氯仿與甲醇的體積比為1∶1），充分振蕩后， 4 500 r/min離心15 min，取氯仿層，加入等體積0.1%氯化鈉溶液，混勻，4 500 r/min離心15 min，用已知重量的蒸餾瓶收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器揮發(fā)除去氯仿，稱重，計(jì)算油脂產(chǎn)量和菌體含油量（油脂得率）。

油脂產(chǎn)量=油脂質(zhì)量/所用發(fā)酵液體積

油脂含量=（油脂質(zhì)量/干菌體質(zhì)量）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 突變菌株Y1m發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)油脂的合成很重要。培養(yǎng)時(shí)間不足，菌體總數(shù)達(dá)不到最大而影響油脂產(chǎn)量；培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，微生物個(gè)體變形、自溶形成的油脂進(jìn)入培養(yǎng)基難以收集[8]。在固定其他發(fā)酵條件下，采用發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間分別為2、3、4、5、6 d的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基進(jìn)行接種發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表1。表1結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.92 g/L。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，油脂產(chǎn)量有所下降，此時(shí)菌體開(kāi)始利用所積累的油脂維持代謝。

2.1.2 溶氧量對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 溶氧量是影響菌體細(xì)胞油脂含量的因素之一，產(chǎn)油微生物利用糖類物質(zhì)合成油脂時(shí)需要氧氣參與。固定其他發(fā)酵條件不變，設(shè)置發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基的100 mL三角瓶裝液量分別為三角瓶容量的1/10、1/5、 3/10、2/5進(jìn)行接種發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表2。表2結(jié)果表明，產(chǎn)脂發(fā)酵時(shí)裝液量為搖瓶容量的1/5時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.75 g/L，隨著裝液量的增加油脂產(chǎn)量下降。

2.1.3 發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基初始pH對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 培養(yǎng)基的初始pH不僅影響菌體的生長(zhǎng)，而且影響菌體內(nèi)部油脂的積累[9]。固定其他發(fā)酵條件不變，采用初始pH分別為5.0、5.8、6.0、7.0、8.0的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基接種發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表3。表3結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵液的初始pH 6.0時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.03 g/L。

2.1.4 接種量對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 接種量的大小決定了菌種在搖瓶培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)繁殖速度[10]，固定其他發(fā)酵條件不變，取發(fā)酵液體積5%、10%、20%、30%的種子液，離心后分別制成等體積不同細(xì)胞數(shù)的菌懸液，接種菌懸液后發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵結(jié)果（表4）表明，當(dāng)種子液的接種量為10%時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.32 g/L。

2.1.5 溫度對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 適宜的溫度促進(jìn)產(chǎn)油微生物油脂的合成，固定其他發(fā)酵條件不變，分別在溫度為15、25、27、30、35 ℃條件下進(jìn)行接種發(fā)酵，在不同發(fā)酵溫度下油脂產(chǎn)量最高時(shí)刻的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。表5結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂溫度為27 ℃時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.21 g/L。

2.1.6 金屬離子對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 金屬離子是菌體胞內(nèi)酶的激活劑，發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中它們含量的多少能夠影響到油脂的產(chǎn)量[11，12]。分別以硫酸鋅0.3 mg/L、氯化鈣0.5 g/L、氯化鐵1.0 mg/L、硫酸銅0.08 mg/L作為單因素試驗(yàn)梯度中間值，固定其他發(fā)酵條件不變，加入不同含量的金屬鹽進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6至表9。表6結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中硫酸鋅含量為0.5 mg/L時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.89 g/L。表7結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中氯化鈣含量為0.3 g/L時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.06 g/L。表8結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中氯化鐵含量為0.5 mg/L時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.63 g/L。表9結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中硫酸銅含量為0.05 mg/L時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.10 g/L。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)突變菌株Y1m發(fā)酵條件單因素優(yōu)化后可知，發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.92 g/L。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，油脂產(chǎn)量有所下降，此時(shí)菌體開(kāi)始利用所積累的油脂維持代謝。100 mL三角瓶裝液量為其容量的1/5時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.75 g/L，隨著裝液量的增加油脂產(chǎn)量下降。當(dāng)發(fā)酵液的初始pH 6.0時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.03 g/L。當(dāng)種子液的接種量為10%時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.32 g/L。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂溫度為27 ℃時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.21 g/L。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中硫酸鋅含量為0.5 mg/L，氯化鈣含量為0.3 g/L，氯化鐵含量為0.5 mg/L，硫酸銅含量為0.05 mg/L時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，含量過(guò)高或者過(guò)低都不能夠促進(jìn)油脂的積累。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯 鄭 威）

1.2.4 油脂含量測(cè)定 每克干菌體加入4 mol/L HCl 6 mL，振蕩混勻，室溫下放置30 min后，沸水浴 3 min，-20 ℃速冷，加入10 mL氯仿與甲醇的混合試劑（氯仿與甲醇的體積比為1∶1），充分振蕩后， 4 500 r/min離心15 min，取氯仿層，加入等體積0.1%氯化鈉溶液，混勻，4 500 r/min離心15 min，用已知重量的蒸餾瓶收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器揮發(fā)除去氯仿，稱重，計(jì)算油脂產(chǎn)量和菌體含油量（油脂得率）。

油脂產(chǎn)量=油脂質(zhì)量/所用發(fā)酵液體積

油脂含量=（油脂質(zhì)量/干菌體質(zhì)量）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 突變菌株Y1m發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)油脂的合成很重要。培養(yǎng)時(shí)間不足，菌體總數(shù)達(dá)不到最大而影響油脂產(chǎn)量；培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，微生物個(gè)體變形、自溶形成的油脂進(jìn)入培養(yǎng)基難以收集[8]。在固定其他發(fā)酵條件下，采用發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間分別為2、3、4、5、6 d的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基進(jìn)行接種發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表1。表1結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.92 g/L。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，油脂產(chǎn)量有所下降，此時(shí)菌體開(kāi)始利用所積累的油脂維持代謝。

2.1.2 溶氧量對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 溶氧量是影響菌體細(xì)胞油脂含量的因素之一，產(chǎn)油微生物利用糖類物質(zhì)合成油脂時(shí)需要氧氣參與。固定其他發(fā)酵條件不變，設(shè)置發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基的100 mL三角瓶裝液量分別為三角瓶容量的1/10、1/5、 3/10、2/5進(jìn)行接種發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表2。表2結(jié)果表明，產(chǎn)脂發(fā)酵時(shí)裝液量為搖瓶容量的1/5時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.75 g/L，隨著裝液量的增加油脂產(chǎn)量下降。

2.1.3 發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基初始pH對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 培養(yǎng)基的初始pH不僅影響菌體的生長(zhǎng)，而且影響菌體內(nèi)部油脂的積累[9]。固定其他發(fā)酵條件不變，采用初始pH分別為5.0、5.8、6.0、7.0、8.0的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基接種發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表3。表3結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵液的初始pH 6.0時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.03 g/L。

2.1.4 接種量對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 接種量的大小決定了菌種在搖瓶培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)繁殖速度[10]，固定其他發(fā)酵條件不變，取發(fā)酵液體積5%、10%、20%、30%的種子液，離心后分別制成等體積不同細(xì)胞數(shù)的菌懸液，接種菌懸液后發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵結(jié)果（表4）表明，當(dāng)種子液的接種量為10%時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.32 g/L。

2.1.5 溫度對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 適宜的溫度促進(jìn)產(chǎn)油微生物油脂的合成，固定其他發(fā)酵條件不變，分別在溫度為15、25、27、30、35 ℃條件下進(jìn)行接種發(fā)酵，在不同發(fā)酵溫度下油脂產(chǎn)量最高時(shí)刻的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。表5結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂溫度為27 ℃時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.21 g/L。

2.1.6 金屬離子對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 金屬離子是菌體胞內(nèi)酶的激活劑，發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中它們含量的多少能夠影響到油脂的產(chǎn)量[11，12]。分別以硫酸鋅0.3 mg/L、氯化鈣0.5 g/L、氯化鐵1.0 mg/L、硫酸銅0.08 mg/L作為單因素試驗(yàn)梯度中間值，固定其他發(fā)酵條件不變，加入不同含量的金屬鹽進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6至表9。表6結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中硫酸鋅含量為0.5 mg/L時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.89 g/L。表7結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中氯化鈣含量為0.3 g/L時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.06 g/L。表8結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中氯化鐵含量為0.5 mg/L時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.63 g/L。表9結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中硫酸銅含量為0.05 mg/L時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.10 g/L。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)突變菌株Y1m發(fā)酵條件單因素優(yōu)化后可知，發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.92 g/L。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，油脂產(chǎn)量有所下降，此時(shí)菌體開(kāi)始利用所積累的油脂維持代謝。100 mL三角瓶裝液量為其容量的1/5時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.75 g/L，隨著裝液量的增加油脂產(chǎn)量下降。當(dāng)發(fā)酵液的初始pH 6.0時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.03 g/L。當(dāng)種子液的接種量為10%時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.32 g/L。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂溫度為27 ℃時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.21 g/L。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中硫酸鋅含量為0.5 mg/L，氯化鈣含量為0.3 g/L，氯化鐵含量為0.5 mg/L，硫酸銅含量為0.05 mg/L時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，含量過(guò)高或者過(guò)低都不能夠促進(jìn)油脂的積累。

參考文獻(xiàn)：

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[9] 張 玲，李植峰，譚亞芳，等.一種簡(jiǎn)便、快速的真菌油脂提取方法[J].生物技術(shù)，1999，9（6）：43-44.

[10] 陳朝洋.面包酵母誘變株M413的選育及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)選[J].福州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1997，25（5）：107-110.

[11] 王 華，李 靜，王冬梅，等.金屬離子對(duì)斯達(dá)油脂酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2010，10（2）：67-73.

[12] 王 莉，孫玉梅，王培忠，等.金屬離子對(duì)發(fā)酵性絲孢酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響[J].大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，24（4）：259-262.

（責(zé)任編輯 鄭 威）

1.2.4 油脂含量測(cè)定 每克干菌體加入4 mol/L HCl 6 mL，振蕩混勻，室溫下放置30 min后，沸水浴 3 min，-20 ℃速冷，加入10 mL氯仿與甲醇的混合試劑（氯仿與甲醇的體積比為1∶1），充分振蕩后， 4 500 r/min離心15 min，取氯仿層，加入等體積0.1%氯化鈉溶液，混勻，4 500 r/min離心15 min，用已知重量的蒸餾瓶收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器揮發(fā)除去氯仿，稱重，計(jì)算油脂產(chǎn)量和菌體含油量（油脂得率）。

油脂產(chǎn)量=油脂質(zhì)量/所用發(fā)酵液體積

油脂含量=（油脂質(zhì)量/干菌體質(zhì)量）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 突變菌株Y1m發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)油脂的合成很重要。培養(yǎng)時(shí)間不足，菌體總數(shù)達(dá)不到最大而影響油脂產(chǎn)量；培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，微生物個(gè)體變形、自溶形成的油脂進(jìn)入培養(yǎng)基難以收集[8]。在固定其他發(fā)酵條件下，采用發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間分別為2、3、4、5、6 d的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基進(jìn)行接種發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表1。表1結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.92 g/L。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，油脂產(chǎn)量有所下降，此時(shí)菌體開(kāi)始利用所積累的油脂維持代謝。

2.1.2 溶氧量對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 溶氧量是影響菌體細(xì)胞油脂含量的因素之一，產(chǎn)油微生物利用糖類物質(zhì)合成油脂時(shí)需要氧氣參與。固定其他發(fā)酵條件不變，設(shè)置發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基的100 mL三角瓶裝液量分別為三角瓶容量的1/10、1/5、 3/10、2/5進(jìn)行接種發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表2。表2結(jié)果表明，產(chǎn)脂發(fā)酵時(shí)裝液量為搖瓶容量的1/5時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.75 g/L，隨著裝液量的增加油脂產(chǎn)量下降。

2.1.3 發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基初始pH對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 培養(yǎng)基的初始pH不僅影響菌體的生長(zhǎng)，而且影響菌體內(nèi)部油脂的積累[9]。固定其他發(fā)酵條件不變，采用初始pH分別為5.0、5.8、6.0、7.0、8.0的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基接種發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表3。表3結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵液的初始pH 6.0時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.03 g/L。

2.1.4 接種量對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 接種量的大小決定了菌種在搖瓶培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)繁殖速度[10]，固定其他發(fā)酵條件不變，取發(fā)酵液體積5%、10%、20%、30%的種子液，離心后分別制成等體積不同細(xì)胞數(shù)的菌懸液，接種菌懸液后發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵結(jié)果（表4）表明，當(dāng)種子液的接種量為10%時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.32 g/L。

2.1.5 溫度對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 適宜的溫度促進(jìn)產(chǎn)油微生物油脂的合成，固定其他發(fā)酵條件不變，分別在溫度為15、25、27、30、35 ℃條件下進(jìn)行接種發(fā)酵，在不同發(fā)酵溫度下油脂產(chǎn)量最高時(shí)刻的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。表5結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂溫度為27 ℃時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.21 g/L。

2.1.6 金屬離子對(duì)突變菌株Y1m產(chǎn)油脂的影響 金屬離子是菌體胞內(nèi)酶的激活劑，發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中它們含量的多少能夠影響到油脂的產(chǎn)量[11，12]。分別以硫酸鋅0.3 mg/L、氯化鈣0.5 g/L、氯化鐵1.0 mg/L、硫酸銅0.08 mg/L作為單因素試驗(yàn)梯度中間值，固定其他發(fā)酵條件不變，加入不同含量的金屬鹽進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6至表9。表6結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中硫酸鋅含量為0.5 mg/L時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.89 g/L。表7結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中氯化鈣含量為0.3 g/L時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.06 g/L。表8結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中氯化鐵含量為0.5 mg/L時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.63 g/L。表9結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中硫酸銅含量為0.05 mg/L時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.10 g/L。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)突變菌株Y1m發(fā)酵條件單因素優(yōu)化后可知，發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.92 g/L。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，油脂產(chǎn)量有所下降，此時(shí)菌體開(kāi)始利用所積累的油脂維持代謝。100 mL三角瓶裝液量為其容量的1/5時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為3.75 g/L，隨著裝液量的增加油脂產(chǎn)量下降。當(dāng)發(fā)酵液的初始pH 6.0時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.03 g/L。當(dāng)種子液的接種量為10%時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.32 g/L。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂溫度為27 ℃時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，為4.21 g/L。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中硫酸鋅含量為0.5 mg/L，氯化鈣含量為0.3 g/L，氯化鐵含量為0.5 mg/L，硫酸銅含量為0.05 mg/L時(shí)，突變菌株Y1m油脂產(chǎn)量最高，含量過(guò)高或者過(guò)低都不能夠促進(jìn)油脂的積累。

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（責(zé)任編輯 鄭 威）