張明杰

（廣東紫金正天藥業(yè)有限公司，河源 517000）

重組酵母產人IFN-α2a與LL-37融合蛋白的工藝優(yōu)化

張明杰

（廣東紫金正天藥業(yè)有限公司，河源 517000）

通過單因素試驗探索重組酵母P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的最佳條件。結果顯示，重組酵母菌產蛋白酶的最佳表達條件是利用BMMY為誘導培養(yǎng)基，以接種量OD600=5.5、溫度26℃、pH6.0、誘導劑（甲醇）為每隔24 h添加1.0%、振蕩速度為200 r/min條件下連續(xù)誘導144 h。在最佳培養(yǎng)條件下，發(fā)酵液中的LL-37最高抗菌活性達27.9 mm。與初始的發(fā)酵條件相比，人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的產量提高了32.29%。

干擾素α2a LL-37 工藝

英國科學家Isaacs和Lindenmann于1957年發(fā)現一種能干擾病毒感染的細胞因子，命名為干擾素［1］。隨著人類研究的深入，不斷發(fā)現了許多新的干擾素分子。目前，人類在哺乳動物中發(fā)現的干擾素共有10個家族，其中人干擾素有7個家族。按其功能和作用方式，可將人干擾素細分為I型、II型和III型。I型包括α、β、ε、τ、ω、κ，具有抗病毒和抗腫瘤的功能；II 型包括γ，具有調節(jié)免疫的功能［2］；III型為干擾素樣蛋白，功能與I型類似，但受體不同［3］。人IFN-α2a是由165個氨基酸殘基構成，具有防治病毒性疾病［4］和惡性腫瘤［5］的功能。LL-37是目前在人體內發(fā)現的抗菌肽Cathelicedin家族中唯一的成員，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有較廣譜的抗性［6］。除此之外，LL-37還具有免疫調節(jié)作用，可趨化單核細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞和肥大細胞等［7］。當人體受到病原微生物、炎癥或創(chuàng)傷刺激，LL-37的表達水平就會上升［8］。動物試驗表明，LL-37可明顯降低銅綠假單胞菌感染小鼠的死亡率［2］。

將人LL-37基因與IFN-α2a融合表達，形成同時具有抗病毒、抗腫瘤和抗菌的三重功效的新功能蛋白，在一些特殊的臨床治療中存在潛在的市場需求。本課題組前期的工作實現了在畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115表達三功能的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白。在進入工業(yè)化生產之前，有必要建立所構建的基因工程菌工藝條件，并對產品的應用

性能進行驗證。本研究通過單因素試驗旨在探索重組酵母P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 P. pastoris GS115LI，表達人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白。大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922，用于檢測融合蛋白的抗菌活性。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 YPD培養(yǎng)基 酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，121℃滅菌30 min。

1.1.2.2 BMGY培養(yǎng)基 見參考文獻［10］。

1.1.2.3 BMMY培養(yǎng)基 同BMGY培養(yǎng)基，僅將其中的甘油10 mL換為甲醇5 mL。

1.1.2.4 初始培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)：保藏的菌種先經YPD活化，后將入BMGY培養(yǎng)基，接種量2%，后振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度28℃，轉速200 r/min，培養(yǎng)時間24 h。

誘導培養(yǎng)：種子培養(yǎng)液離心去培養(yǎng)液，后接種入BMMY培養(yǎng)液，使酵母OD600值達6.0，在溫度28℃與轉速150 r/min下振蕩培養(yǎng)，每24 h補充甲醇0.5%（體積比）誘導表達［11］，重復誘導5次。

1.2 方法

1.2.1 單因素發(fā)酵試驗

1.2.1.1 誘導時長對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 按出發(fā)條件進行誘導，誘導過程中每12 h取樣分析發(fā)酵液抗菌活性，直至檢測的抗菌活性不再上升。

1.2.1.2 接種量對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 按前述確定的最佳誘導時長，分別調節(jié)接種量以OD600計為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，其它條件不變。誘導完成后取發(fā)酵液分析抗菌活性。

1.2.1.3 溫度對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 在出發(fā)條件的基礎上，按前述確定的最佳誘導時間與接種量，改變誘導溫度，分別置于24℃、26℃、28℃、30℃和32℃下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)完后取樣檢測產物的抗菌活性。

1.2.1.4 溶氧對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 通過改變搖床的轉速探索溶氧對重組P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響。分別選擇搖床轉速為120、160、240和280 r/min進行誘導培養(yǎng)，其它條件參照前述選擇的最佳條件。誘導結束后取發(fā)酵液分析抗菌活性。

1.2.1.5 誘導劑（甲醇）添加量對P. pastoris GS115-LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 通過改變誘導劑甲醇的添加量分別對體積比為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%和1.6%的菌株進行誘導表達。其它誘導條件為前述所確定的最佳條件。誘導結束后取發(fā)酵液分析抗菌活性。

1.2.1.6 pH對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響 為了探索pH對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響，分別選擇pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0進行試驗。其它發(fā)酵條件為前述優(yōu)化的最佳條件。誘導結束后取發(fā)酵液分析抗菌活性。

1.2.2 驗證試驗 在上述確定的最適培養(yǎng)和誘導表達條件下，重復試驗3次，進行驗證。

1.2.3 發(fā)酵液中人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的抗菌活性分析 培養(yǎng)液中LL-37的活性測定參照文獻［5］。用E. coli ATCC 25922作為檢測菌種，用雙層瓊脂糖打孔法測定。底層培養(yǎng)基上打直徑3 mm的圓孔，每孔加10 μL發(fā)酵液，37℃孵化3 h后，在底層上覆蓋一層營養(yǎng)瓊脂，37℃繼續(xù)培養(yǎng)20 h，測量無菌生長的透明圈直徑。

2 結果

2.1 誘導時長的影響

誘導時長對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結果（圖1）顯示，誘導開始后的前24 h，發(fā)酵液中檢測出的以抗菌活性表示的融合蛋白產量上升較慢，這可能與菌體本身處于環(huán)境適應期的延遲期有關；而后產量呈直線上升，至第132 h，此后產量緩慢上升，至144 h達到最大值25.3 mm；此后24 h的誘導期內，融合蛋白產量出現輕微下降，可能是由于宿主老化后，產品有所降解引起。根據以上試驗結果，確定144 h為最佳誘導時長。

圖1 誘導時長對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.2 接種量的影響

接種量對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結果（圖2）顯示，隨著接種量自OD600=3.5上升，在其它條件不變的情況下，發(fā)酵液中以LL-37抗菌活性表示的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白逐漸上升，至接種量達到OD600=5.5后，達到最大值約26.0 mm；之后，呈現逐漸下降的趨勢。這表明，當OD600＜5.5，發(fā)酵液中的酵母濃度太少，導致表達能力低。在OD600=5.5時達到飽和。之后再升高酵母濃度，可能由于營養(yǎng)或溶氧供應受限，從而導致產物的合成能力不升反降。在此，選擇接種量為OD600≈5.5作為最佳的接種條件。

圖2 接種量對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.3 溫度的影響

溫度對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結果（圖3）顯示，在溫度為26℃時，以抗菌活性表示的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白產量最高，可達26.5 mm以上。溫度低于26℃，產量會有所下降，可能與低溫下酵母代謝活性受影響有關。溫度高于26℃，產量也出現下降，可能與在溫度高時，酵母自身代謝加快后，衰老同樣加快的原因。綜合上述情況，選擇26℃作為誘導時的最佳溫度條件。

圖3 溫度對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.4 溶氧的影響

在搖瓶階段，溶氧難以直接測定，故只能采用以搖床振蕩轉速為依據來進行探索。溶氧對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結果（圖4）顯示，在振蕩轉速低于200 r/min時，由于溶氧處于受限狀態(tài)，故以抗菌活性表示的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白產量較低。振蕩轉速高于200 r/min后，產量不再繼續(xù)上升，表明此階段溶氧已經到達飽和。綜合考慮效應與成本，選擇200 r/min作為誘導表達時最佳的溶氧控制條件。

圖4 溶氧對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.5 誘導劑（甲醇）添加量的影響

誘導劑（甲醇）添加量對P. pastoris GS115LI產

人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結果（圖5）顯示，甲醇濃度添加量為1.0%（以體積比計，下同）時，以抗菌活性計的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白表達量達最大，約為27 mm。低于1.0%，可能是由于誘導的強度不夠，表達速度下降，致使產物產量下降。高于1.0%，可能是由于誘導強度太大，超出了宿主菌的代謝負荷，反而產生負作用，從而也使表達量下降。綜合考慮選擇1.0%為誘導的最佳甲醇用量。

圖5 甲醇添加量對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.6 pH的影響

pH對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響結果（圖6）顯示，試驗條件下，pH6.0時人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的表達量最高，達到27.5 mm以上。pH主要通過影響細胞膜及基質的帶電狀態(tài)，從而影響膜對基質的通透性，再傳遞到對產物產量的影響。酵母的最適生長pH為偏酸性的環(huán)境，此處產物最佳表達量所需的pH6.0，恰好可在不影響宿主本身生長條件下實現產物的最佳表達，故確定pH6.0為最佳條件。

圖6 pH對P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的影響

2.7 最佳工作條件驗證

根據前面的試驗結果，確定P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的最佳工藝條件為利用BMMY培養(yǎng)基，接種量以OD600計為5.5、溫度26℃、pH6.0、誘導劑（甲醇）為每隔24 h添加1%、振蕩速度為200 r/min條件下連續(xù)誘導144 h。在該工藝條件下重復驗證3次，得到結果（以LL-37抗菌活性計）分別為27.8、28.1和27.9 mm，平均值為27.93±0.12（mm）。該結果與出發(fā)培養(yǎng)條件下的表達量（21.1 mm，參考1.2.1.1誘導時間120 h時的結果）相比，產物產量提高了32.39%。

3 討論

LL-37作為人源性抗菌肽，已經在臨床上獲得廣泛的應用。由于其分子小，與其它蛋白多肽或蛋白類藥物融合表達時，不易對與其融合蛋白的功能產生影響，因此將LL-37與其它蛋白融合表達生產多功能藥物成為可能［13］。例如，將LL-37與人酸性成纖維細胞生長因子融合表達形成的新蛋白，既具有酸性成纖維細胞生長因子促進傷口愈合的功能，又具有防止傷口感染的功能［14］。受此思路的啟發(fā)，將LL-37與人IFN-α2a融合表達，構建出了同時具有抗癌、抗病毒和抗菌的三效藥物。發(fā)酵工藝是將構建的蛋白轉化為產物的關鍵。

從單因素試驗的各因素變化所引起的人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白表達水平的波動情況分析，接種量、時間和pH是3個較為敏感的量，其它屬于次敏感量，這可能預示著這些因素對表達產量的關鍵程度。接種量主要影響發(fā)酵時延遲期的長短和菌體與營養(yǎng)之間的協調關系。接種量小，延遲期長，產物合成量低；接種量大，菌體濃度高，會引起營養(yǎng)競爭［15］。pH不僅影響宿主菌對外源基因的表達，同時也可能對產物的穩(wěn)定性及活性產生影響［16］。適宜的培養(yǎng)條件，有利于提高細胞的相對活性和延長細胞的高相對活性狀態(tài)，從而實現融合蛋白產量的最大化累積［17，18］。各因素之間的影響還需要通過正交試驗或序貫試驗設計，利用統(tǒng)計學的原理進行詳細分析。

試驗中為了操作的方便，僅以LL-37的抗菌

活性進行表征。經過在菌種構建階段的試驗確認，LL-37的抗菌活性檢測與IFN-α2a干擾素活性檢測結果是相一致的，表明二者既實現了融合，而且融合蛋白還同時保留了二者各自獨立時的活性（結果發(fā)表在本課題組另一篇文章中）。

本試驗所有數據均是建立在搖瓶的試驗基礎之上的。眾所周知，搖瓶并不能真正代替發(fā)酵罐的生產，因此本試驗的結果還只能是發(fā)酵生產的參考。在達到生產水平之前，還需通過小型發(fā)酵罐進一步優(yōu)化工藝參數，再逐步放大至生產規(guī)模。

4 結論

本研究確定了重組畢赤酵母P. pastoris GS115LI產人LL-37基因與IFN-α2a融合蛋白的最佳工藝條件為利用BMMY培養(yǎng)基、接種量以OD600=5.5、溫度26℃、pH6.0、誘導劑（甲醇）為每隔24 h添加1%、振蕩速度為200 r/min條件下連續(xù)誘導144 h。與出發(fā)條件相比，產量提高了32.29%。

［1］Borden EC, Sen GC, Uze G, et al. Interferons at age 50：past, current and future impact on biomedicine［J］. Nature Reviews Drug Discovery, 2007, 6（12）：975-990.

［2］Pestka S. The interferons：50 years after their discovery, there is much more to learn［J］. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282（28）：20047-20051.

［3］O' Brien TR. Interferon-alfa, interferon-lambda and hepatitis C［J］. Nat Genet, 2009, 41（10）：1048-1050.

［4］Beilharz MW, Cummins JM, Bennett AL. Protection from lethal influenza virus challenge by oral type 1 interferon［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, 355（3）：740-744.

［5］Bodaghi B, Gendron G, Wechsler B, et al. Efficacy of interferon alpha in the treatment of refractory and sight threatening uveitis：a retrospective monocentric study of 45 patients［J］. British Journal of Ophthalmology, 2007, 91（3）：335-339.

［6］Chen X, Niyonsaba F, Ushio H, et al. Synergistic effect of antibacterial agents human β-defensins, cathelicidin LL-37 and lysozyme against Staphylococcus aureus and Escherichia coli［J］. Journal of Dermatological Science, 2005, 40（2）：123-132.

［7］Mookherjee N, Lippert DND, Hamill P, et al. Intracellular receptor for human host defense peptide LL-37 in monocytes［J］. The Journal of Immunology, 2009, 183（4）：2688-2696.

［8］Kai-Larsen Y, Agerberth B. The role of the multifunctional peptide LL-37 in host defense［J］. Frontiers in Bioscience：A Journal and Virtual Library, 2007, 13：3760-3767.

［9］Jacobsen F, Mittler D, Hirsch T, et al. Transient cutaneous adenoviral gene therapy with human host defense peptide hCAP-18/ LL-37 is effective for the treatment of burn wound infections［J］. Gene Therapy, 2005, 12（20）：1494-1502.

［10］柯野, 羅曉春, 謝明權.米曲堿性蛋白酶基因的克隆表達及水解特性研究［J］.華南理工大學學報：自然科學版, 2012, 40（8）：40-45.

［11］湯鳴強, 薛盛果, 葉鵬.米曲霉F-81產中性蛋白酶的固定化條件及其特性［J］.生物技術通報, 2012（3）：159-165.

［12］楊云霞, 朱玲, 王伯瑤, 等.人抗菌肽LL-37突變分子的特性和抗菌能力的比較.華西藥學雜志, 2006, 21（5）：422-424.

［13］Dannehl C, Gutsmann T, Brezesinski G. Surface activity and structures of two fragments of the human antimicrobial LL-37［J］. Colloids and Surfaces B：Biointerfaces, 2013, 109：129-135.

［14］Shen J, Lu X, Jin X, et al. Expression of a novel dual-functional protein-The antimicrobial peptide LL-37 fused with human acidic fibroblast growth factor in Escherichia coli［J］. Protein Expression and Purification, 2012, 81（1）：119-125.

［15］Charoenrat T, Khumruaengsri N, Promdonkoy P, et al. Improvement of recombinant endoglucanase produced in Pichia pastoris KM71 through the use of synthetic medium for inoculum and pH control of proteolysis［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2013, 116（2）：193-198.

［16］Reinholz M, Ruzicka T, Schauber J. Cathelicidin LL-37：an antimicrobial peptide with a role in inflammatory skin disease［J］. Annals of Dermatology, 2012, 24（2）：126-135.

［17］Potvin G, Ahmad A, Zhang Z. Bioprocess engineering aspects of heterologous protein production in Pichia pastoris：A review［J］. Biochemical Engineering Journal, 2012, 64：91-105.

［18］Lo TM, Teo WS, Ling H, et al. Microbial engineering strategies to improve cell viability for biochemical production［J］. Biotechnology Advances, 2013, 31（6）：903-914.

（責任編輯 馬鑫）

The Process Optimization of Pichia pastoris GS115LI for Producing Fused Protein of LL-37 and IFN-α2a

Zhang Mingjie
（Pharmaceutical Co.，Ltd. Guangdong Zijing Zhengtian，Heyuan 517000）

With experiments of single factor, the optimal process of recombinant P. pastoris GS115LI for producing fused protein of LL-37 and IFN-α2a were using BMMY as inducing medium, inoculum as OD600=5.5, temperature as 26℃, pH6.0, inducing chemical（methanol）adding amount as 1.0% every 24 h, incubating shaking speed as 200 r/min, and inducing time as 144 h. Under those optimal conditions, the 27.9 mm of LL-37 antimicrobial activity could be gotten. Compared with the original conditions, the productivity of fused protein of LL-37 and IFN-α2a was increased as 32.29%.

Interferon-α2a LL-37 Fermentation process

2014-03-18

廣東省重大科技專項（2011A080502011）

張明杰，教授，研究方向：微生物工程技術；E-mail：mingjiezh@126.com