王義強(qiáng)王啟業(yè)馬國(guó)輝林麗云

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004；2.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004；3.國(guó)家林業(yè)局生物乙醇研究中心，長(zhǎng)沙 410004）

戊糖乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸及高產(chǎn)菌株誘變選育

王義強(qiáng)1，2，3王啟業(yè)1馬國(guó)輝1林麗云1

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004；2.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004；3.國(guó)家林業(yè)局生物乙醇研究中心，長(zhǎng)沙 410004）

戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）是能利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸的潛力菌株，發(fā)酵條件優(yōu)化與高產(chǎn)菌株的選育是提高乳酸產(chǎn)量的重要手段。通過(guò)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman設(shè)計(jì)與響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)戊糖乳桿菌ATCC 8041產(chǎn)乳酸的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，該菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組合為葡萄糖93.11 g/L、酵母浸粉5.19 g/L、碳酸鈣29.43 g/L、蛋白胨10.00 g/L、Na2HPO4·12H2O 5.00 g/L、MgSO40.20 g/L、MnSO450 mg/L；最佳發(fā)酵條件為37℃、pH6.5、接種量6%、裝液量80%。在此優(yōu)化條件下，該菌株發(fā)酵產(chǎn)乳酸為54.12 g/L。進(jìn)一步以戊糖乳桿菌ATCC 8041為出發(fā)菌株，通過(guò)原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變，經(jīng)多重篩選，最終獲得一株遺傳穩(wěn)定性好的高產(chǎn)乳酸突變株，命名為戊糖乳桿菌Lactic UVC-02，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保存，注冊(cè)號(hào)為CCTCC M 2013209。該突變株Lactic UVC-02經(jīng)葡萄糖發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量達(dá)64.17 g/L，比出發(fā)菌株ATCC 8041（54.12 g/L）提高18.6%。

戊糖乳桿菌 乳酸發(fā)酵 紫外誘變 響應(yīng)面試驗(yàn)

乳酸（Lactic acid），又名丙醇酸，是一種在人體、動(dòng)植物、微生物體內(nèi)普遍存在的有機(jī)酸［1］。乳酸及其衍生物可廣泛應(yīng)用于食品、化工、紡織、制革、電子、醫(yī)藥以及農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域［2，3］。隨著環(huán)境污染問(wèn)題

日益嚴(yán)重，應(yīng)用新技術(shù)開(kāi)發(fā)新型塑料，從而解決傳統(tǒng)塑料造成的“白色污染”問(wèn)題，已成為各國(guó)研究的熱點(diǎn)［4］。乳酸可聚合生產(chǎn)聚乳酸來(lái)制造生物降解塑料、綠色包裝材料及農(nóng)業(yè)薄膜。聚乳酸無(wú)毒，無(wú)刺激性，具有較好的生物相容性和生物降解性。以聚乳酸來(lái)加工成塑料可解決日益嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題，引起世界的廣泛關(guān)注。乳酸的生產(chǎn)方法有酶合成法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法3種［5］。工業(yè)化生產(chǎn)多采用前兩種方法，但它們目前面臨原料來(lái)源有限、成本急劇增加的困境，最主要的是生產(chǎn)過(guò)程中帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此，通過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸將成為未來(lái)發(fā)展的主要趨勢(shì)。

目前，能應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)乳酸的微生物只有霉菌中的根霉屬和細(xì)菌中的乳酸菌類［6-8］。利用根霉屬的米根霉生產(chǎn)乳酸在國(guó)內(nèi)外研究很多，但其發(fā)酵產(chǎn)乳酸存在糖轉(zhuǎn)化率低（理論值75%）、有氧混合發(fā)酵成本高和副產(chǎn)物多等不足［5，9］。乳酸細(xì)菌能利用葡萄糖（或可利用的碳水化合物）發(fā)酵產(chǎn)乳酸，糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)90%以上，且發(fā)酵成本低，產(chǎn)物主要為L(zhǎng)-型乳酸和D-乳酸混合物［10］。部分乳酸菌甚至可利用木質(zhì)纖維素的水解產(chǎn)物，如木糖、阿拉伯糖等五碳糖，發(fā)酵產(chǎn)生乳酸［11-13］。

傳統(tǒng)的乳酸發(fā)酵常以糧食作物為底物，不僅浪費(fèi)糧食，且使乳酸價(jià)格高昂。因此，尋找和選育能夠利用木質(zhì)纖維素水解液為原料的高產(chǎn)乳酸菌株迫在眉睫。因傳統(tǒng)誘變具有誘變效率高且不易回復(fù)突變等特性，工業(yè)生產(chǎn)上乳酸菌種的選育多數(shù)是以傳統(tǒng)的誘變選育為主［14］。戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）ATCC 8041不僅能利用六碳糖也能利用五碳糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，是能利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸的潛力菌株［15］。本研究首次采用紫外線對(duì)出發(fā)菌株戊糖乳桿菌ATCC 8041原生質(zhì)體進(jìn)行誘變處理，期望篩選出高產(chǎn)乳酸突變株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本試驗(yàn)所用的戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）ATCC 8041購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS肉湯活化培養(yǎng)基：眎蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，山梨醇酐單油酸1 g/L，檸檬酸銨2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CH3COONa·3H2O 7.73 g/L，Na2HPO4·12H2O 5.04 g/L，H2O 1 000 mL，固體培養(yǎng)基添加15 g/L的瓊脂，pH6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖90 g/L，眎蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，Na2HPO4·12H2O 5 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CaCO330 g/L。

種子培養(yǎng)基（改良的MRS培養(yǎng)基）：眎蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、牛肉膏10 g/L、葡萄糖20 g/L、山梨醇酐單油酸1 g/L、檸檬酸銨2 g/L、MnS04·H2O 0.05 g/L、三水合乙酸鈉7.73 g/L、十二水合磷酸氫二鈉5.04 g/L，pH6.5。

斜面培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加瓊脂20 g/L。

篩選培養(yǎng)基：改良的MRS培養(yǎng)基中加入0.01%溴鉀酚綠。

高滲再生培養(yǎng)基：采用雙層瓊脂法，用0.7 mol/L NaCl配制MRS培養(yǎng)基，上層含2%瓊脂，下層含3%的瓊脂。

滲透壓穩(wěn)定劑：0.7 mol/L NaCl溶液。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 取1 mL MRS肉湯培養(yǎng)基于安瓿管中溶解菌體，稀釋后涂布平板，培養(yǎng)3 d；取平板培養(yǎng)菌落接種于含10 mL種子培養(yǎng)基的25 mL試管，37℃靜置培養(yǎng)10 h為一級(jí)種子液。取1 mL一級(jí)種子液接種于含100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶，37℃恒溫?fù)u床中150 r/min培養(yǎng)10 h后用于試驗(yàn)。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗(yàn) 以乳酸產(chǎn)量為考察指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中的7個(gè)組分：葡萄糖（60、75、90、105、120和135 g/L）、蛋白胨（0、5、10、15和20 g/L）、酵母粉（0、2.5、5、7.5和10 g/L）、Na2HPO4·12H2O（0、2.5、5、7.5和10 g/L）、MgSO4（0、0.1、0.2、0.3、0.4和 0.5 g/L）、MnSO4·H2O（0、25、50、75和100 mg/L）、CaCO3（0、10、20、30、40、50和60 g/L）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，除目標(biāo)因素外，其余培養(yǎng)基組分均按發(fā)酵培養(yǎng)基和已篩選因素中的較佳條件進(jìn)行試驗(yàn)，每組3個(gè)平行，37℃厭氧發(fā)酵72 h，液相色譜檢測(cè)產(chǎn)物，結(jié)果取平均值。

1.2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面試驗(yàn) 在

單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定低水平（-1）值，高水平（1）為低水平的1.25倍，選取影響乳酸產(chǎn)量較大的7個(gè)因素（葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、Na2HPO4、MgSO4、MnSO4、CaCO3）進(jìn)行全面考察，選用N=12的PB設(shè)計(jì)，以乳酸產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析軟件Minitab15進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)［16，17］，根據(jù)軟件給出的試驗(yàn)矩陣表確定各試驗(yàn)組的編碼與取值進(jìn)行試驗(yàn)，再根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，篩選出重要影響因素。

根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)［18，19］，所得結(jié)果利用軟件以乳酸產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值做響應(yīng)面分析，從而獲得培養(yǎng)基中重要因子的最佳組合。

1.2.4 發(fā)酵條件單因素試驗(yàn) 在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，以乳酸產(chǎn)量為考察指標(biāo)，分別對(duì)溫度（31、33、35、37、39、41和43℃）、初始pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6、6.5和7.0）、種子液接種量（2%、4%、6%、8%、10%和12%）及100 mL發(fā)酵瓶裝液量（65%、70%、75%、80%、85%、90%和95%） 依次進(jìn)行單因素試驗(yàn)。除目標(biāo)因素外，其余培養(yǎng)條件按已篩選的最佳條件進(jìn)行試驗(yàn)，每組3個(gè)平行，進(jìn)行厭氧發(fā)酵，液相色譜檢測(cè)，結(jié)果取平均值。

1.2.5 原生質(zhì)體制備 取10 mL液體種子培養(yǎng)物于滅過(guò)菌的離心管中，4 000 r/min 離心15 min，去上清液，用無(wú)菌生理鹽水洗滌收集的菌體兩次，加入3 mL含溶菌酶的滲透壓穩(wěn)定劑中，將制備的菌酶混合液在30℃的條件下酶解2 h，將酶解液3 000 r/min離心15 min，取上清液收集原生質(zhì)體，將原生質(zhì)體懸浮于10 mL滲透壓穩(wěn)定劑中備用。

1.2.6 原生質(zhì)體紫外誘變 取5 mL經(jīng)高滲溶液稀釋后原生質(zhì)體溶液，混勻，倒入直徑9 mm的培養(yǎng)皿中，在磁力攪拌下距功率20 W的紫外燈35 cm處進(jìn)行0、20、40、60、80、100和120 s紫外照射。誘變結(jié)束后，取不同時(shí)間的處理液100 μL涂布在高滲再生培養(yǎng)基上，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，37℃條件下恒溫避光培養(yǎng)72 h。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)，繪制致死曲線。致死率（%）=（對(duì)照1 mL菌液中活菌數(shù)-處理后1 mL菌液中活菌數(shù)）/對(duì)照1 mL菌液中活菌數(shù)×100%。

1.2.7 高產(chǎn)突變株的篩選 將最佳處理原生質(zhì)體稀釋涂布于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，72 h后用無(wú)菌牙簽將菌落轉(zhuǎn)接在篩選培養(yǎng)基平板上。2 d后培養(yǎng)基為綠色，菌株的代謝產(chǎn)物乳酸會(huì)使菌落周圍pH降低，形成黃色顯色圈，挑取顯色圈較大的90株菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，每個(gè)菌株接1瓶，37℃培養(yǎng)，72 h后測(cè)其乳酸產(chǎn)量。得到乳酸產(chǎn)量較高的菌株再次進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩，每株3瓶，37℃培養(yǎng)，72 h后測(cè)其乳酸產(chǎn)量。

1.2.8 高產(chǎn)突變株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)篩選獲得的高活性的突變株進(jìn)行繼代培養(yǎng)，連續(xù)繼代8次，每代5個(gè)平行，測(cè)其乳酸產(chǎn)量，分析其穩(wěn)定性。

1.2.9 乳酸的液相色譜法檢測(cè)

1.2.9.1 采用液相色譜［20］測(cè)定發(fā)酵液中乳酸的含量 色譜條件：色譜儀為安捷倫1100［含在線脫氣機(jī)，可變波長(zhǎng)檢測(cè)器（VWD），agilent 1100四元泵］，色譜柱為EDipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm 1.d. 5 μm），流動(dòng)相為0.005 mol/L H2SO4溶液，pH2.5（用NaOH調(diào)節(jié)），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量20 μm，柱溫為室溫。

1.2.9.2 流動(dòng)相配制 0.27 mL分析純濃硫酸用水稀釋并定容至1 000 mL（0.005 mol/L），用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5，然后用0.45 μm孔徑的合成纖維素酯膜過(guò)濾。

1.2.9.3 對(duì)照品制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取乳酸1 g標(biāo)準(zhǔn)品放入10 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容至10 mL，配成乳酸標(biāo)準(zhǔn)液，然后進(jìn)行稀釋，分別配成0.5、1、2、4和5 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用0.45 μm孔徑的合成纖維素酯膜過(guò)濾。再分別經(jīng)液相色譜檢測(cè)，以濃度為橫坐標(biāo)，峰高值為縱坐標(biāo)，繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.9.4 樣品的制備 取5 mL發(fā)酵液（5 000 r/min，10 min）除去碳酸鈣，加5 mL 0.01 mol/L的硫酸溶

液進(jìn)行酸解10 min，離心除去硫酸鈣，以0.45 μm的濾膜過(guò)濾，取1 mL濾液適量稀釋即得待測(cè)液。

2 結(jié)果

2.1 戊糖乳桿菌ATCC 8041最佳發(fā)酵培養(yǎng)基確定

發(fā)酵培養(yǎng)基中的7個(gè)因素的單因素試驗(yàn)結(jié)果為葡萄糖90 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、Na2HPO4·12H2O 5 g/L、MgSO40.2 g/L、MnSO4·H2O 50 mg/L、CaCO330 g/L時(shí)對(duì)戊糖乳桿菌 ATCC8041發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響較大。在此基礎(chǔ)上，選取這7個(gè)對(duì)乳酸產(chǎn)量影響較明顯的因素進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)（表1），得到了2個(gè)對(duì)乳酸產(chǎn)量影響顯著的因素：葡萄糖質(zhì)量濃度和酵母粉質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)圖2。在此基礎(chǔ)上對(duì)葡萄糖、酵母浸粉以及第三影響因子CaCO3做響應(yīng)面試驗(yàn)（表2），得到了預(yù)測(cè)乳酸產(chǎn)量的模型：

Y=54.00+1.62X1+0.33X2-0.020X3-0.075X1X2-0.020X1X3+0.020X2X3-2.58X12-0.79X22-0.22X32

其中X1為葡萄糖質(zhì)量濃度，X2為酵母浸粉質(zhì)量濃度，X3為CaCO3質(zhì)量濃度。

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)（表3）得出，葡萄糖質(zhì)量濃度、酵母浸粉質(zhì)量濃度兩個(gè)因素對(duì)乳酸產(chǎn)量影響均達(dá)到顯著水平。各因素影響乳酸產(chǎn)量的大小順序?yàn)椋浩咸烟牵窘湍附郏綜aCO3。二次回歸模型的R2為0.9997，方程P值＜0.05，失擬檢驗(yàn)P值為0.2500＞0.05，失擬不顯著，試驗(yàn)結(jié)果可靠。因此模型選擇正確，可用于預(yù)測(cè)乳酸產(chǎn)量。

Design-Expert軟件預(yù)測(cè)和驗(yàn)證試驗(yàn)表明，發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組合為：葡萄糖93.11 g/L、酵母浸粉5.19 g/L、碳酸鈣29.43 g/L、蛋白胨10.00 g/L、Na2HPO4·12H2O 5.00 g/L、MgSO40.20 g/L、MnSO450 mg/L。

2.2 戊糖乳桿菌ATCC 8041最佳發(fā)酵條件的確定

在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵條件做單因素試驗(yàn)，結(jié)果（圖3-圖7）顯示，得到較佳發(fā)酵條件為：溫度37℃、初始pH6.5、接種量6%、裝液量80%。在培養(yǎng)基與發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，得到出發(fā)菌株發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乳酸產(chǎn)量為54.11 g/L。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

圖2 七個(gè)因素的效應(yīng)Pareto圖分析

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 戊糖乳桿菌ATCC 8041最佳誘變劑量的確定

戊糖乳桿菌ATCC 8041最佳紫外誘變劑量的確定結(jié)果（圖7）顯示，隨著紫外照射時(shí)間的增加，菌體的致死率有逐漸增加的趨勢(shì)。當(dāng)照射時(shí)間為40

s時(shí)，菌體的致死率為85.54%，而60 s時(shí)紫外照射的致死率為97.84%。研究表明，當(dāng)致死率為80%-90%之間時(shí)，菌體的誘變效果和生存能力的比例最好，從而確定在功率20 W的紫外燈，距離35 cm照射條件下，最佳誘變劑量為40 s。

表3 方差分析及顯著性檢驗(yàn)

圖3 溫度對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響

圖4 初始pH對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響

圖5 接種量對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響

圖6 裝液量對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響

圖7 Lactobacillus pentosus ATCC 8041紫外致死率曲線

2.4 高產(chǎn)乳酸突變株的選育

出發(fā)菌株經(jīng)紫外誘變后經(jīng)篩選培養(yǎng)基初篩，觀察篩選平板，正常產(chǎn)酸菌落會(huì)產(chǎn)生黃色顯色圈（圖

8-B），挑取黃色較深的90株菌落進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果（表4）顯示，紫外誘變后正突變?yōu)?2.22%，負(fù)突變?yōu)?8.89%，38.89%的菌株沒(méi)有明顯差異。在正突變菌株中，平均產(chǎn)量提高幅度為7.4%，最大產(chǎn)量提高率達(dá)到18.84%。進(jìn)一步對(duì)正突變菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵測(cè)乳酸產(chǎn)量進(jìn)行再?gòu)?fù)篩，結(jié)果（表5）顯示，經(jīng)過(guò)再次復(fù)篩，突變株Lactic UVC-02和Lactic UVD-05產(chǎn)量較對(duì)照高15%以上。故對(duì)突變株Lactic UVC-02和Lactic UVD-05進(jìn)行傳代培養(yǎng)，檢驗(yàn)其遺傳穩(wěn)定性。

圖8 出發(fā)菌株和突變株菌落形態(tài)

表 4 出發(fā)菌株紫外誘變結(jié)果

表5 突變株發(fā)酵復(fù)篩結(jié)果

2.5 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

將突變株Lactic UVC-02進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代8次，測(cè)定其乳酸產(chǎn)量（每代重復(fù)5次）如表6所示。進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6。由方差分析可以看出，F(xiàn) crit=2.31是α=0.05的F統(tǒng)計(jì)量臨界值，F(xiàn)=1.58是F統(tǒng)計(jì)量的計(jì)算值，1.58＜2.31，P=0.177，故數(shù)據(jù)間無(wú)顯著差異，說(shuō)明突變株Lactic UVC-02遺傳穩(wěn)定性好。

表6 突變株Lactic UVC-02遺傳穩(wěn)定性及方差分析

將突變株Lactic UVD-05進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代8次，其乳酸產(chǎn)量如表7所示（每代重復(fù)5次）。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，見(jiàn)表7。由方差分析可以看出，F(xiàn) crit=2.31，是α=0.05的F統(tǒng)計(jì)量臨界值，F(xiàn)=4.64是F統(tǒng)計(jì)量的計(jì)算值，4.64＞2.31，P=0.001，數(shù)據(jù)間差異顯著，說(shuō)明突變株Lactic UVD-05的遺傳穩(wěn)定性差。

表7 突變株Lactic UVD-05遺傳穩(wěn)定性及方差分析

通過(guò)對(duì)突變株Lactic UVC-02和Lactic UVD-05的遺傳穩(wěn)定性比較表明，Lactic UVC-02的穩(wěn)定性

優(yōu)于Lactic UVD-05，故確定突變株Lactic UVC-02為一株高產(chǎn)乳酸突變株，命名為戊糖乳桿菌Lactic UVC-02，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保存，注冊(cè)號(hào)為CCTCC M 2013209。該突變株Lactic UVC-02經(jīng)葡萄糖發(fā)酵后，乳酸產(chǎn)量達(dá)到64.17 g/L，比出發(fā)菌株（54.12 g/L）提高18.6%，為進(jìn)一步利用木質(zhì)纖維發(fā)酵產(chǎn)乳酸提供了研究基礎(chǔ)。

3 討論

在發(fā)酵工業(yè)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化對(duì)發(fā)酵水平的提高有著重大作用，而合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)方法的選擇在探索最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的過(guò)程中尤為重要［19］。Plackett-Burman（P-B）法是一種以不完全平衡塊為原理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，它能夠從眾多的過(guò)程變量中快速、有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素，為進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。響應(yīng)面分析法是1951年Box Wilson開(kāi)發(fā)的用于研究多因子系統(tǒng)中因子交互作用達(dá)到最大響應(yīng)值時(shí)所對(duì)應(yīng)的最佳條件，結(jié)合數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)對(duì)重要因子響應(yīng)過(guò)程變量進(jìn)行數(shù)學(xué)建模分析，定向優(yōu)化響應(yīng)因子［21］。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者通過(guò)P-B設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法在乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方面取得了很好的成就［22-27］。本研究通過(guò)P-B設(shè)計(jì)快速有效地從7個(gè)影響乳酸產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)基組分中篩選出3個(gè)顯著性影響組分：葡萄糖、酵母浸粉和碳酸鈣，然后利用響應(yīng)面分析法中Box-Behnken設(shè)計(jì)得出最佳培養(yǎng)基組合：葡萄糖93.11 g/L、酵母浸粉5.19 g/L、碳酸鈣29.43 g/L、蛋白胨10 g/L、Na2HPO4·12H2O 5 g/L、MgSO40.2 g/L、MnSO450 mg/L。在最佳培養(yǎng)基組合下，乳酸產(chǎn)量達(dá)到54.11 g/L，與預(yù)測(cè)值擬合較好。說(shuō)明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化戊糖乳桿菌ATCC8041發(fā)酵產(chǎn)乳酸是合理可靠的。

微生物誘變育種是指利用各種誘變劑處理微生物細(xì)胞，以提高其基因突變頻率，再通過(guò)適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法，誘變育種的速度快、成本低、耗時(shí)短、方法簡(jiǎn)便，是一種高效的菌株選育方法。其中的紫外線輻射方法更具有操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求低，且出現(xiàn)正突變的幾率較高，誘變的效果好，是一種非常實(shí)用的誘變劑［28］。在微生物發(fā)酵產(chǎn)乳酸方面，利用紫外誘變篩選優(yōu)良菌株也取得了良好的效果。仲松等［29］以干酪乳桿菌ZZ-L為出發(fā)菌株，對(duì)其原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變，篩選得到一株比原始菌株乳酸產(chǎn)量高20.7%的高產(chǎn)突變菌株ZZ-06。吳慧昊等［30］使用紫外照射和亞硝基胍復(fù)合誘變的方法選育出一株在低溫下生長(zhǎng)良好、遺傳性狀穩(wěn)定的菌株Q1-4-6。Yin等［31］采用紫外和亞硝基胍復(fù)合誘變的方法得到突變株Rhizopus oryzae LA-UN-1，乳酸產(chǎn)量達(dá)到59.5 g/L，比原始菌株提高54.5%。本研究以能同時(shí)利用六碳糖和五碳糖的戊糖乳桿菌ATCC 8041為出發(fā)菌，制備了原生質(zhì)體，并對(duì)其原生質(zhì)體懸液進(jìn)行紫外誘變，期望獲得能利用木質(zhì)纖維水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸的高產(chǎn)突變株。突變體經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩等一系列過(guò)程篩選出乳酸產(chǎn)量較高的2個(gè)菌株：Lactic UVC-02與Lactic UVD-05，對(duì)其進(jìn)行了8代繼代培養(yǎng)檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定性，其中突變株Lactic UVC-02遺傳穩(wěn)定性較好，各代之間無(wú)顯著差異。突變株菌落形態(tài)與原始菌株也出現(xiàn)一定程度的差異，引起這種差異的原因還需進(jìn)一步在分子水平進(jìn)行分析研究。由于木質(zhì)纖維原材料處理過(guò)程復(fù)雜且周期較長(zhǎng)，目前我們已初步得出突變株Lactic UVC-02能利用楊木水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸，但暫時(shí)還未能完全驗(yàn)證該突變株是否能高效利用木質(zhì)纖維水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸，這也是我們下一步工作的研究重點(diǎn)。

4 結(jié)論

戊糖乳桿菌ATCC 8041發(fā)酵產(chǎn)乳酸的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件組合為：葡萄糖93.11 g/L、酵母浸粉5.19 g/L、碳酸鈣29.43 g/L、蛋白胨10.00 g/L、Na2HPO4·12H2O 5.00 g/L、MgSO40.20 g/L、MnSO450 mg/L；最佳發(fā)酵條件為溫度37℃、pH6.5、接種量6%、裝液量80%。進(jìn)一步對(duì)戊糖乳桿菌ATCC8041進(jìn)行原生質(zhì)體誘變得到高產(chǎn)突變株Lactic UVC-02，保存在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（注冊(cè)號(hào)：CCTCC M 2013209），其乳酸產(chǎn)量達(dá)到64.17 g/L，比原始菌株產(chǎn)量提高了18.6%。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Lactobacillus pentosus Fermentation Lactic Acid Production and High Yield Strain Mutation Breeding

Wang Yiqiang1，2，3Wang Qiye1Ma Guohui1Lin Liyun1
（1. Biotechnology Laboratory of Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004；2. Key Lab of Non-wood Forest Nurturing and Protection of National Ministry of Education，Changsha 410004；3. Bio-ethanol Research Center of State Forestry Administration，Changsha 410004）

Lactobacillus pentosus is a potential strain which can make use of the lignocellulose hydrolysate fermentation to produce lactic acid, optimization of fermentation conditions and the breeding of high yield strain are the important means to improve lactic acid production. Fermentation medium and fermentation conditions were optimized for strain Lactobacillus pentosus ATCC 8041, through single factor experiment, Plackett-Burman design and response surface experiment. The results showed that the best combination of fermentation medium is 93.11 g/L glucose, 5.19 g/L yeast powder, 29.43 g/L calcium carbonate, 10.00 g/L peptone, 5.00 g/L Na2HPO4·12H2O, 0.20 g/L MgSO4, 50 mg/L MnSO4. The best fermentation conditions is temperature 37℃, pH6.5, quantity of 6%, and fluid amount 80%. The lactic acid production is 54.12 g/L under the optimized fermentation medium and fermentation conditions. And then, Lactobacillus pentosus ATCC 8041 was taken as the original strain, treated with UV mutation ATCC 8041 protoplast, after through multiple screening, finally we have got a mutant which has high lactic acid production, named Lactobacillus pentosus lactic UVC-02 which conserved in China Center for Type Culture Collection, registration number for CCTCC M 2013209. The results for glucose fermentation showed that lactic UVC-02 produced 64.17 g/L lactic acid, which was 18.6% higher than the original strain.

Lactobacillus pentosus Lactic acid fermentation UV mutation Response surface experiment

2014-03-27

國(guó)家林業(yè)局“948“項(xiàng)目（2011-4-13）

王義強(qiáng)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)胞工程與生物能源；E-mail：wangyiqiang12@163.com