甘甜 冷向軍 郭婷 胡靜 魏靜 李小勤

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 教育部水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用重點實驗室，上海 201306）

草魚PAX7基因的克隆、序列分析及組織表達(dá)

甘甜 冷向軍 郭婷 胡靜 魏靜 李小勤

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 教育部水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用重點實驗室，上海 201306）

配對盒基因7（Paired box 7 gene，PAX7）在神經(jīng)嵴發(fā)育及原腸胚形成、肌肉自主更新與再生中扮演著重要角色，對細(xì)胞更新、分化、凋亡等起著十分重要的調(diào)控作用。參照GenBank中斑馬魚、線鰭電鰻和虹鱒等物種PAX7序列的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，獲得草魚PAX7基因的部分序列，長645 bp，編碼214個氨基酸，包含編碼128個氨基酸的PAX7蛋白配對框（PD）。氨基酸序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，草魚PAX7基因與其他物種具有高度的相似性，與斑馬魚、線鰭電鰻、日本青鳉、金頭鯛、虹鱒、大西洋鮭、北極嘉魚、人、野牦牛、褐家鼠和小鼠的PAX7氨基酸序列同源性可達(dá)90%-97%；各物種PAX7部分氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，草魚與斑馬魚、日本青鳉、北極嘉魚、大西洋鮭、虹鱒、線鰭電鰻和金頭鯛聚為一大支，小鼠、褐家鼠，野牦牛與人類另聚一支，所得結(jié)果符合物種傳統(tǒng)分類進(jìn)化地位。運用實時熒光定量PCR檢測草魚PAX7基因在各組織中的差異表達(dá)，結(jié)果顯示PAX7基因在肌肉中表達(dá)量最高；其次是前腸和皮膚，在心、腦、腎和肝中僅少量表達(dá)，所得結(jié)果與該基因的功能相一致。

PAX7基因 草魚 序列分析 組織差異表達(dá)

PAX基因，又名配對盒基因，因其各成員均含有配對結(jié)構(gòu)域（Paired box）而得名，該基因不同成員間有的含有同源域（Homeodomain，HD），有的不含同源域，有的含有八肽域（Octapeptide，OP），有的不含八肽域［1］。因該基因的所有成員均含有配對結(jié)構(gòu)域而導(dǎo)致不同成員間在功能上的部分相似。目前，已發(fā)現(xiàn)果蠅PAX基因有10個成員，其中PAX7最早是在果蠅胚胎體節(jié)中被發(fā)現(xiàn)［2］。而在脊椎動物上，已發(fā)現(xiàn)9個成員（PAX1-PAX9），根據(jù)其功能結(jié)構(gòu)域的不同將其分為4個亞家族［3］：（1）PAX1和 PAX9；（2）PAX2、PAX5和 PAX8；（3）PAX3和PAX7；（4）PAX4和PAX6。其中，PAX7基因是PAX家族中第Ⅲ亞家族的一員，該基因包含一個配對框（Paired Box domain，PD）、一個同源域（Homeodomain，HD）、一個八肽結(jié)構(gòu)（Octapeptide，OP）和數(shù)個外顯子編碼的轉(zhuǎn)錄區(qū)［4］，八肽結(jié)構(gòu)在配對框和同源域之間，配對框和同源域是DNA結(jié)合區(qū)。配對框通過選擇性剪接方式產(chǎn)生4種PAX7轉(zhuǎn)錄物（PAX7a-d），經(jīng)體外模型研究發(fā)現(xiàn)，正常胚胎及成人肌組織持續(xù)表達(dá)這4種不同的轉(zhuǎn)錄物［5］。

PAX蛋白是一類非常保守的轉(zhuǎn)錄因子，其中的PAX7主要通過自身配對結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合引發(fā)一系列基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而引起相應(yīng)的生理反應(yīng)，其研究主要集中在大腦和肌肉組織。它能促進(jìn)幼小鼠［4］、北極嘉魚［6］和斑馬魚［7］胚胎的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，以及成年鼠［8］視神經(jīng)損傷的再建，還能刺激人［9］、小鼠［4，10］、斑馬魚［11］、線鰭電鰻［12］及北極嘉魚［6］骨骼肌發(fā)育與自我更新、肌肉損傷的再生與修復(fù)，但PAX7過表達(dá)會引發(fā)肌肉肥大［13］甚至肌源性腫瘤［14］。此外，PAX7基因還被用作體外原代肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)的鑒定基因。因為成熟肌肉組織中除成熟肌細(xì)胞外，還有肌衛(wèi)星細(xì)胞和非肌源性細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、常駐巨噬細(xì)胞、纖維/脂肪祖細(xì)胞（FAPs）和微脈管系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞等［15］。如何鑒別出其中的肌衛(wèi)星細(xì)胞顯得尤為重要。Seale等［16］研究發(fā)現(xiàn)成年小鼠PAX7在肌源性衛(wèi)星細(xì)胞系即衛(wèi)星細(xì)胞和增殖成肌細(xì)胞中表達(dá)，而在非肌源性細(xì)胞系包括如成纖維細(xì)胞系、轉(zhuǎn)染腺病毒E1A基因的人腎上皮細(xì)胞系、間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞系、子宮頸癌細(xì)胞系、人乳腺癌細(xì)胞系等中不表達(dá)。因此，PAX7基因的表達(dá)與否，被用于是否是肌源性細(xì)胞的鑒別依據(jù)，以及肌肉組織培養(yǎng)物的篩選。目前，已有Reimann［17］、徐青［18］、陳巖［19］、單艷菊［20］、羅桂芬［21］和Weber等［12］分別在人、壁虎、雞、鴨、豬和線鰭電鰻上將PAX7基因作為體外原代肌衛(wèi)星細(xì)胞鑒定基因的報道。

GenBank中已有PAX7基因氨基酸序列報道的魚類有斑馬魚（NP_001139621.1）、線鰭電鰻（ACC86106.1）、日本青鳉（BAN57331.1）、金頭鯛（AEV53628.1）、虹鱒（NP_001245265.1）、大西洋鮭（CAF02090.1）和北極嘉魚（CAG25522.1）等，其中有相關(guān)文獻(xiàn)報道的僅見斑馬魚胚胎PAX7作為肌源性調(diào)節(jié)因子在生皮肌節(jié)樣組織中的表達(dá)［22］以及在神經(jīng)嵴、色素細(xì)胞系和色素干細(xì)胞的鑒定［23］；北極嘉魚［6］幼魚PAX7在顱頜面、肌肉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的重要作用；四倍體大西洋鮭［24］幼魚PAX7基因多個剪切體的識別以及成魚PAX7基因在不同組織中的差異表達(dá)。而草魚尚無關(guān)于PAX7基因序列及相關(guān)研究報道，本試驗首次對草魚PAX7基因片段進(jìn)行克隆，旨在為草魚肌肉組織原代細(xì)胞培養(yǎng)后肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定提供依據(jù)，為探明外源性營養(yǎng)對于肌纖維的形成及調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 試驗用草魚由上海海洋大學(xué)特種養(yǎng)殖場提供，基因克隆用草魚體重約為（10±0.5）g，將魚體用酒精消毒去皮后，采集背鰭下方側(cè)線上方肌肉組織于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。組織差異表達(dá)試驗用草魚體重為（1.3±0.1）kg，解剖后取其肝臟、腎臟、皮膚、肌肉、心臟、腦和前腸用液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑與儀器 RNAiso Plus總RNA提取試 劑、PrimeScript? Reverse Transcriptase、Ex Taq酶、DNA Marker2000、SYBR? Premix Ex Taq（Perfect Real Time）均為TaKaRa公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠、pMD19-T質(zhì)粒試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、Agarose瓊脂糖、IPTG、X-gal購自天根生化科技公司；LB培養(yǎng)基購自上海生工公司；DNA純化試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；核酸染料Gold view

（GV）購自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司；其它試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)。

臺式高速冷凍離心機(jī)（5810R，Eppendorf公司，德國）；蛋白核酸分析儀（Smart SpecTMplus，Bio-Rad公司，美國）；梯度PCR儀（C1000，Bio-Rad公司，美國）；凝膠成像系統(tǒng)（Biorad GelDoc XR，Bio-Rad公司，美國）；熒光定量PCR儀（7500，ABI公司，美國）；電泳儀（CYY-6C，北京市六一儀器廠）；ABI3730XL測序儀（ABI公司，美國，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 PAX7基因克隆

1.2.1.1 肌肉組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 取草魚肌肉組織，按TaKaRa RNAiso Plus RNA提取試劑說明書提取總RNA，按照TaKaRa PrimeScript Reverse Transcriptase（反轉(zhuǎn)錄酶）試劑盒方法以O(shè)ligo（dT）18為引物合成cDNA第一鏈。

1.2.1.2 引物設(shè)計及 PCR 擴(kuò)增反應(yīng) 根據(jù)GenBank中已報道的斑馬魚Danio rerio（BC163502.1）、線鰭電鰻Sternopygus macrurus（EU624121.1）、虹鱒Oncorhynchus mykiss（NM_001258337.1）等物種的PAX7基因核苷酸保守序列設(shè)計簡并引物（表1），送上海生工生物工程有限公司合成。

采用25 μL擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：10×Ex Taq Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4 μL，上下游引物各0.5 μL（10 μmol），Ex Taq酶0.25 μL，模板1 μL，RNase free dH2O 16.25 μL，擴(kuò)增程序：95℃ 4 min；95℃ 30 s，56.5℃ 30 s，72℃ 30 s，37個循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗后用于DNA純化。

1.2.1.3 目的基因的克隆和測序 根據(jù)瓊脂糖凝膠微量DNA回收試劑盒說明書純化回收目的基因，將純化產(chǎn)物與載體以摩爾比3∶1的添加量與pMD19-T載體在16℃連接6 h，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有IPTG、X-gal和氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)，挑取多個白色菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)6-12 h，再通過菌液PCR篩選陽性重組克隆，送上海美吉測序公司測序。所得序列翻譯成氨基酸序列后進(jìn)行同源性分析，采用MEGA4構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。運用NCBI蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）工具CDD（Conserved Domain Database）分析所得草魚PAX7基因蛋白結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 組織差異表達(dá)分析

1.2.2.1 實時熒光定量 PCR 根據(jù)克隆獲得的草魚PAX7基因片段序列設(shè)計熒光定量PCR引物（表1），擴(kuò)增片段長82 bp，另據(jù)草魚β-actin（DQ211096.1）設(shè)計內(nèi)參基因引物（表1），擴(kuò)增片段長152 bp。

提取肝臟、腎臟、皮膚、肌肉、心臟、腦、前腸組織的RNA，方法同1.2.1.1，按PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

實時熒光定量PCR根據(jù)TaKaRa SYBR?Premix-Ex Taq（Perfect Real Time）試劑盒說明書進(jìn)行，采用20 μL反應(yīng)體系：SYBR? Premix Ex Taq（2×）10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA模板2 μL，Rox Reference DyeⅡ 0.5 μL，ddH2O 6.5 μL；熒光定量PCR擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，55℃退火34 s，40個循環(huán)；后95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s進(jìn)行熔解曲線檢測，每個樣本3個重復(fù)。分別制作內(nèi)參基因β-actin和目的基因PAX7的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以檢測實時熒光定量PCR引物的特異性和試驗的可靠性。選取合適的濃度梯度進(jìn)行實時熒光定量PCR 反應(yīng)，以各濃度模板的Ct值位于15-30之間為宜。

表1 PAX7基因克隆及熒光定量PCR所用引物

1.2.2.2 不同組織mRNA相對表達(dá)量計算 以草魚β-actin基因為內(nèi)參，對得到的各組織樣品Ct值進(jìn)行均一化處理，并以各組織中最低表達(dá)量組織為基準(zhǔn)，用2-△△Ct法計算不同組織PAX7基因mRNA的相對

表達(dá)量。采用SPSS17.0中one-way ANOVA進(jìn)行差異顯著性檢驗，P＜0.05表明差異顯著，結(jié)果以平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s）。

2 結(jié)果

2.1 PAX7基因克隆及序列分析

肌肉總RNA提取質(zhì)量檢測結(jié)果（圖1）顯示，條帶清晰，RNA完整性好，濃度為268 μg/mL，OD260/280為1.86，符合反轉(zhuǎn)錄PCR試驗要求。

以簡并引物PAX7-F1、PAX7-R1及草魚肌肉cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)UV檢測結(jié)果（圖2）顯示，獲得了一條長約647 bp的單一條帶，片段大小與預(yù)期的目的片段基本一致。

圖2 草魚PAX7基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

草魚PAX7基因片段的克隆測序結(jié)果以及利用SMS在線工具包進(jìn)行序列分析的結(jié)果（圖3）顯示，所得草魚PAX7基因序列長645 bp，編碼214個氨基酸（GenBank登錄號：KJ195463）。

運用NCBI在線工具CDD（Conserved Domain Database）分析所得草魚PAX7基因蛋白結(jié)構(gòu)域（圖4）顯示，紅色區(qū)域為PAX7配對框（PD），共128個氨基酸。

圖3 草魚PAX7基因部分序列及推測的氨基酸序列

經(jīng)BLASTP 程序搜索 GenBank 的 Non-redundant protein sequences（nr）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PAX7部分序列氨基酸同源性比對，結(jié)果顯示所得草魚PAX7部分氨基酸序列與斑馬魚 Danio rerioⅡPAX7b（NP_001139621.1）、線鰭電鰻Sternopygus macrurus（ACC86106.1）、斑馬魚Danio rerioⅠPAX7a（AAI63492.1）、日本青鳉Oryzias latipesⅠPAX7a（BAN57331.1）、金頭鯛Sparus aurata（AEV53628.1）、虹鱒Oncorhynchus mykissⅡPAX7b（NP_001245265.1）、大西洋鮭Salmo salar（CAF02090.1）、北極嘉魚Salvelinus alpines（CAG25522.1）、人Homo sapiens（CAA84513.1）、野牦牛Bos grunniens mutus（ELR4572-2.1）、褐家鼠Rattus norvegicus（NP_001178913.1）和小鼠Mus musculus（EDL13317.1）的PAX7氨基酸序列相似性依次為97%、97%、96%、96%、94%、93%、91%、91%、92%、91%、90%和90%。

利用MEGA4軟件以鄰位相接（Neighbor joining，NJ）法構(gòu)建的各物種PAX7部分氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果（圖5）顯示，草魚與斑馬魚Ⅱ聚成一支，后與日本青鳉聚成一小支，再與北極嘉魚、大西洋鮭、虹鱒、線鰭電鰻、斑馬魚Ⅰ、金頭鯛聚為一大支，小鼠、褐家鼠與人類、野牦牛另聚一支，所得結(jié)果符合物種傳統(tǒng)分類進(jìn)化地位。

2.2 草魚PAX7基因的組織差異表達(dá)

運用實時熒光定量PCR技術(shù)，以最低表達(dá)量腦組織為校準(zhǔn)樣本計算草魚各組織的相對表達(dá)量，構(gòu)建草魚PAX7基因的組織表達(dá)譜。表2和圖6顯示，PAX7基因在草魚肌肉、腎、心、腦、皮膚、肝和

前腸均有表達(dá)，在肌肉組織中表達(dá)量最高，顯著高于其他組織（P＜0.05），其次是前腸和皮膚組織，在腎、心、肝、腦組織中少量表達(dá)，顯著低于其他組織（P＜0.05）。

圖4 草魚PAX7部分蛋白結(jié)構(gòu)域分析

圖5 根據(jù)NJ法構(gòu)建PAX7蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

表2 草魚PAX7基因組織表達(dá)

3 討論

PAX7基因的組織差異表達(dá)，僅見在小鼠和魚中有研究。Seale［16］對成年小鼠Northern雜交后發(fā)現(xiàn)PAX7在肌肉組織中特異表達(dá)，在腦、心、腸、腎和肝組織中不表達(dá)。而在水產(chǎn)動物中，Sibthorpe等［6］采用原位雜交技術(shù)研究北極嘉魚PAX7對顱頜面、骨骼肌及中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的重要作用，發(fā)現(xiàn)該基因在個體發(fā)育早期中腦、后腦、脊髓和體節(jié)表達(dá)，在成魚腦和骨骼肌中表達(dá)，其他組織未進(jìn)行檢測；Gotensparre等［24］對四倍體大西洋鮭成魚進(jìn)行組織差異表達(dá)分析后發(fā)現(xiàn)，PAX7基因在腦中表達(dá)量最高，其次是慢肌和快肌，在鰓、脾、心和魚鰾中不表達(dá)，但對皮膚未進(jìn)行檢測。而本試驗結(jié)果顯示PAX7基因在草魚肌肉組織中表達(dá)量最高；其次是前腸和皮膚，腎、心、和肝組織表達(dá)量較低，在腦組織中表達(dá)量最低，所得結(jié)果與前人研究有一定差異，但可以明確的是PAX7基因在各物種肌肉組織中均有高表達(dá)，可見PAX7基因在肌肉中的重要性。

至于PAX7在皮膚和前腸中也有相對較高的表達(dá)，其原因可能與皮膚中分布的大量色素細(xì)胞相關(guān)，

因在斑馬魚幼魚色素細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，PAX7基因在黑色素細(xì)胞、色素干細(xì)胞和神經(jīng)嵴中均有表達(dá)［23］。

圖6 草魚PAX7基因的組織表達(dá)圖譜

關(guān)于腸PAX7的表達(dá)，僅見一篇文獻(xiàn)報道，且是成年小鼠腸PAX7不表達(dá)的報道［16］，本試驗在草魚中的高表達(dá)恰好與其相反。究其原因，可能與腸道的采樣部位有關(guān)，因無胃的草魚前腸與食道相連接的部分有一些由食道的肌層延伸而來的橫紋肌纖維［25］，也有可能與物種特異性有關(guān)。

本試驗在腦組織中低表達(dá)，而不同物種的文獻(xiàn)報道結(jié)果不一致，在幼小鼠［4］和仔稚斑馬魚［7，11］中的研究表明，發(fā)育早期PAX7主要表達(dá)于整個動物腦組織中，后局限于中腦，進(jìn)一步延伸至背側(cè)心室區(qū)甚至整個前后軸。在大西洋鮭成魚腦中PAX7基因也是表達(dá)量最高，而成年小鼠腦組織卻未發(fā)現(xiàn)PAX7表達(dá)［4，16］。因此認(rèn)為，腦組織中PAX7表達(dá)量與種屬相關(guān)，同時也可能受生理、年齡的影響。

4 結(jié)論

本試驗首次成功克隆獲得草魚PAX7基因部分序列，長645 bp，編碼214個氨基酸，與其他物種同源性均在90%以上，系統(tǒng)進(jìn)化樹符合物種傳統(tǒng)分類進(jìn)化地位。該基因在肌肉中高表達(dá)，其次是前腸和皮膚，在心、腦、腎和肝中僅少量表達(dá)。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Tissue Expression Analysis of PAX7 Gene in Grass Carp（Ctenopharyngodon idellus）

Gan Tian Leng Xiangjun Guo Ting Hu Jing Wei Jing Li Xiaoqin
（Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，the College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Ministry of Education，Shanghai 201306）

Paired box gene 7（PAX7）is crucially important to the cellular renewal, differentiation and apoptosis, especially in neural crest development, gastrulation, and muscle self-renewal. The PAX7 domains sequence is conserved among several species, such as zebrafish, apteronotidae, and rainbow trout, and the conserved sequence zebrafish was used to design degenerate primers for reverse-transcription PCR（RTPCR）. A partial sequence of PAX7 from grass carp was obtained for a 645 bp segment encoding a 214 amino acid peptide, containing a paired box domain with 128 amino acids. The deduced protein showed homology to zebrafish（Danio rerio）, apteronotidae（Sternopygus macrurus）, Japanese Medaka（Oryzias latipes）, gilthead bream（Sparus aurata）, rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）, Atlantic salmon（Salmo salar）, Arctic charr（Salvelinus alpinus）, human（Homo sapiens）, wild yak（Bos grunniens mutus）, brown rat（Rattus norvegicus）, and mouse（Mus musculus）with 90%-97% identities. Analysis of the PAX7 phylogenetic tree revealed that the grass carp joined with zebrafish, and there was a confluence of Japanese medaka, Arctic charr, Atlantic salmon, rainbow trout, apteronotidae and gilthead bream. The other branch was consisted of mouse, brown rat, wild yak and human. These results conformed to the traditional species classification evolution status. The expression in tissues was detected by Real-time quantitative PCR, which indicated that the highest level of PAX7 gene expression was found in muscle, a lower expression level was found in foregut and skin, and the lowest detectable level was found in heart, brain, kidney and liver. The results are in agreement with the function of the gene.

PAX7 gene Grass carp（Ctenopharyngodon idellus） Sequence analysis Tissue differential expression

2014-04-22

上海市自然科學(xué)基金項目（13ZR1419600）

甘甜，女，碩士研究生，研究方向：分子營養(yǎng)；E-mail：499314787@qq.com

李小勤，女，碩士，副教授，研究方向：遺傳營養(yǎng)學(xué)；E-mail：xqli@shou.edu.cn