郭奕惠 范嗣剛 黃桂菊 朱克誠 喻達(dá)輝

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510300）

紅羅非魚MyoD基因克隆及序列分析

郭奕惠 范嗣剛 黃桂菊 朱克誠 喻達(dá)輝

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510300）

MyoD基因是MRFs家族中的一員，能調(diào)控肌肉細(xì)胞活性和增殖，在肌肉形成過程中起正調(diào)控作用。采用同源基因克隆和RACE方法獲得紅羅非魚MyoD基因的cDNA序列。開放閱讀框長903 bp，編碼300個(gè)氨基酸，其中第1-114個(gè)氨基酸為堿性結(jié)構(gòu)（Basic domain），第109-165個(gè)氨基酸為螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)（Helix-Loop-Helix domain），第199-213個(gè)氨基酸為周期蛋白依賴性蛋白激酶4（CDK4）結(jié)合區(qū)域，第233-249為Helix III結(jié)構(gòu)，無信號(hào)肽序列。MyoD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)為螺旋-環(huán)-螺旋二聚體。基于MyoD構(gòu)建的魚類系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示紅羅非魚，尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚聚為一支。

MyoD 序列分析 克隆 羅非魚

紅羅非魚（Oreochromis sp.）體呈粉紅色，是莫桑比克羅非魚（O. mossambicus）×尼羅羅非魚（O. niloticus）雜交產(chǎn)生的后代。紅羅非魚生長速度快，產(chǎn)量高、肉味鮮美，經(jīng)濟(jì)效益好，在兩廣地區(qū)可常年養(yǎng)殖，深受養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者喜愛。

大多數(shù)魚類可食性部分主要是肌肉。提高肌肉生長速度能短時(shí)間內(nèi)增加魚的產(chǎn)量，從而增加收益。在分子水平上，魚類肌肉生長受生肌調(diào)節(jié)因子MRFs家族（Myogenic regulatory factors，MRFs）調(diào)控。MRFs家族基因均具有保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域（Basic helix-loop-helix，bHLH），該結(jié)構(gòu)域能與E12和E47等蛋白結(jié)合形成二聚體復(fù)合物，進(jìn)而與E-box（CANNTG）結(jié)合，從而激活肌肉特異性轉(zhuǎn)錄本［1-3］。

MyoD基因（Myogenic differentiation antigen），是MRFs家族中的一員，能調(diào)控肌肉細(xì)胞活性和增殖，在肌肉形成過程中起正調(diào)控作用，缺失后導(dǎo)致成肌細(xì)胞無法進(jìn)行增殖和分化。相反，MyoD基因

的過度表達(dá)會(huì)抑制成肌細(xì)胞的增殖過程，并促進(jìn)成肌細(xì)胞分化形成成熟的肌纖維細(xì)胞［4，5］。1987年首次獲得人的cDNA序列［6］。目前在鯉魚（Cyprinus carpio）［7］、金頭鯛（Sparus aurata）［8］、大口黑鱸（Micropterus salmoide）［9］、 草 魚（Ctenopharyngodon idellus）［10］、奧利亞羅非魚（Oreochromis aureaus）［11］、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）［12］、鱈（Gadus macrocephalus）［13］等魚類中已相繼成功克隆，但尚未有紅羅非魚MyoD基因的研究報(bào)道。本研究擬對紅羅非魚MyoD基因進(jìn)行克隆和序列分析，以期為該基因在水產(chǎn)動(dòng)物中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用紅羅非魚購買于廣州黃沙水產(chǎn)市場。所用試劑如下：Sample protector，Total RNA Isolation kit、Reverse Transcriptase M-MLV，pMD18-T和DNA Purification kit為大連寶生物工程公司（TaKaRa）產(chǎn)品；大腸桿菌DH5α為Tiangen公司產(chǎn)品，用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）試劑盒進(jìn)行3'末端和5'末端的擴(kuò)增。

試驗(yàn)所用引物如表1所示，均在上海生工生物工程有限公司合成。F1和R1、F2和R2是根據(jù)GenBank已登錄的奧利亞羅非魚MyoD（GenBank登錄號(hào)：AF270790）設(shè)計(jì)的特異引物，其中F1和R1用于擴(kuò)增MyoD部分片段；F1和F2用于MyoD 3'RACE；R1和R2用于MyoD 5'RACE。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 取紅羅非魚新鮮肌肉0.15 g，保存在Sample protector（TaKaRa）中，用RNA提取試劑盒（TaKaRa）提取總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。

1.2.2 MyoD cDNA克隆 參照Reverse Transcriptase M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa）說明書獲得紅羅非魚cDNA第一鏈，其中RNA 200 ng，3'Oligo-dT（10 μmol/L）2 μL，RNase-free H2O補(bǔ)齊至6 μL。使用引物F1和R1擴(kuò)增MyoD cDNA部分片段；反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s；35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 7 min，PCR產(chǎn)物放于4℃保存。用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用DNA Purification kit進(jìn)行膠回收，以pMD18-T作為載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR鑒定為陽性克隆的菌液送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

測序得到MyoD cDNA保守序列，設(shè)計(jì)3'RACE引物（F2）和5'RACE基因特異引物（R2）（表1）。利用Clontech公司的SMARTer RACE cDNA Amplification Kit試劑盒進(jìn)行3'末端和5'末端的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化并克隆后進(jìn)行測序。

表1 紅羅非魚MyoD基因克隆所用引物

1.2.3 序列分析 將擴(kuò)增得到的序列用DNAstar軟件拼接，用NCBI ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html）找出基因的編碼區(qū)，用軟件SignalP3.0軟件分析信號(hào)肽［14］，MyoD蛋白序列分析用ProtParam 軟件（http：//au.expasy.org/tools/protpar am.html）預(yù)測蛋白理化性質(zhì)。用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分析蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)［15］。用MEGA 4.0軟件進(jìn)行基因進(jìn)化分析，并用Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹［16］。

2 結(jié)果

通過同源PCR和RACE技術(shù)成功克隆了紅羅非魚MyoD基因，GenBank登錄號(hào)為FJ907953。用軟件拼接和分析后，MyoD cDNA開放閱讀框長903 bp，編碼300個(gè)氨基酸，其中Ser最多，有47個(gè)，占15.7%；其次為Leu（26個(gè)，8.7%），Asp（24個(gè)，8.0%）和Pro（23個(gè)，7.7%）。MyoD基因編碼蛋白分子量為324 81.6，等電點(diǎn)為5.34。

氨基酸序列經(jīng)SignalP3.0在線分析無信號(hào)肽序列，證明其不是分泌蛋白。第1-114個(gè)氨基酸為Basic domain（堿性結(jié)構(gòu)），第109-165個(gè)氨基酸為Helix-Loop-Helix domain（螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)），第199-213個(gè)氨基酸為周期蛋白依賴性蛋白激酶4（CDK4）結(jié)合區(qū)域，第233-249為Helix III結(jié)構(gòu)（圖1）。

圖1 紅羅非魚MyoD基因開放閱讀框序列及其推測的氨基酸序列

用 Swiss model對MyoD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果為螺旋-環(huán)-螺旋二聚體（圖2）。

圖2 MyoD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

根據(jù)紅羅非魚，尼羅羅非魚（ID：GU246715），奧利亞羅非魚（ID：AF270790），斑馬魚（Danio rerio ID：AF318503），鯉魚（ID：AB012882），長絲裂腹魚（Schizothorax dolichonema，ID：KC184122），藍(lán)鯰魚（Ictalurus furcatus，ID：AY562555），點(diǎn)帶石斑魚（Epinephelus coioides，ID：HM190250），黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco，ID：HM363525），大西洋鱈魚（Gadus morhua，ID：AF329903），虹鱒（Oncorhynchus mykiss，ID：X75798），白鯰魚（Ameiurus catus，ID：AY562556）等魚類的MyoD cDNA序列，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果表明，3種羅非魚聚為一支，其中紅羅非魚與尼羅羅非魚親緣關(guān)系更近。

3 討論

動(dòng)物的產(chǎn)肉力與肌纖維的數(shù)量和生長密切相關(guān)。MyoD基因是調(diào)節(jié)肌肉生長發(fā)育的重要因子。堿性結(jié)構(gòu)域和HLH結(jié)構(gòu)域是MyoD保守區(qū)域。堿性結(jié)構(gòu)域是HLH螺旋結(jié)構(gòu)的延伸，是MyoD蛋白與DNA結(jié)合并相互作用的區(qū)域，HLH結(jié)構(gòu)域能與許多其他因子相互作用，是調(diào)控的重要區(qū)域。本研究對紅羅

非魚MyoD基因進(jìn)行了克隆和序列分析。該基因開放閱讀框長903 bp，編碼300個(gè)氨基酸，有典型的bHLH結(jié)構(gòu)，其中堿性結(jié)構(gòu)域?yàn)榈?-114個(gè)氨基酸，HLH結(jié)構(gòu)域?yàn)榈?09-165個(gè)氨基酸。不同物種之間的MyoD基因序列非常保守，與尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚的同源性達(dá)到99%，與人MyoD基因的同源性有56%。表明MyoD蛋白在生物進(jìn)化過程中的保守性。 MyoD基因不存在信號(hào)肽，這與其在肌肉組織中特異性表達(dá)相符，也與該基因的bHLH結(jié)構(gòu)域始于第一氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相一致［17］。

圖3 基于MyoD cDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

本研究基于MyoD開放閱讀框構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明紅羅非魚與尼羅羅非魚親緣關(guān)系最近，其次是與奧利亞羅非魚，這與紅羅非魚是莫桑比克羅非魚×尼羅羅非魚雜交產(chǎn)生的后代有關(guān)。郭奕惠等［18，19］用線粒體Cox1基因及細(xì)胞核ITS1序列分析羅非魚的親緣關(guān)系，結(jié)果表明紅羅非魚與莫桑比克羅非魚的親緣關(guān)系比與尼羅羅非魚的近。目前莫桑比克羅非魚MyoD基因序列還未公布，無法通過該基因序列鑒定紅羅非魚、莫桑比克羅非魚以及尼羅羅非魚的親緣關(guān)系。MyoD所反映的不同魚類之間的親緣關(guān)系基本符合傳統(tǒng)分類，如鯉魚、斑馬魚和長絲裂腹魚均為鯉科魚類聚集在一支，鯰魚和與黃顙魚成一支，羅非魚與石斑魚的親緣關(guān)系比與其他魚類的近。

盧中華等［12］證實(shí)在奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚有兩種MyoD基因（MyoD1和MyoD2）存在，其中MyoD1基因開放閱讀框長903 bp，編碼300個(gè)氨基酸，MyoD2基因的基因開放閱讀框長792 bp，編碼263個(gè)氨基酸，由此可推測本研究克隆得到的紅羅非魚MyoD基因?yàn)镸yoD1。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了紅羅非魚肌肉生長發(fā)育相關(guān)的候選基因——MyoD，并對其cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行了分析，找到了該基因的堿性結(jié)構(gòu)域和bHLH結(jié)構(gòu)域，為開展該基因在紅羅非魚生長發(fā)育過程的作用及與性狀的關(guān)聯(lián)等研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Sequence Analysis of MyoD Gene in Red Tilmpa Oreochromis sp.（O.mossambicus×O.niloticus）

Guo Yihui Fan Sigang Huang Guiju Zhu Kecheng Yu Dahui
（Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization，Ministry of Agriculture；South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300）

As a member of myogenic regulatory factors（MRFs）, MyoD play a positive regulation in the process of muscle proliferating. In this study, MyoD cDNA of Red Tilmpa Oreochromis sp.（O.mossambicus×O.niloticus）was obtained using homology cloning strategy and rapid cDNA end amploification. The results showed that the open reading frame（ORF）of MyoD was 903 bp length and encoded 300 amino acids, including basic helix-loop-helix（bHLH）domain which composed of 1stto 114thamino acids and 109thto 165thamino acids, CDK4 combined structure（199thto 213th）and Helix III structure（233thto 249th）. The signal peptide was not detected in MyoD. The secondary structure of MyoD protein is HLH dimmer. The phylogenetic trees was constructed based on some fish MyoD ORF and suggested that Oreochromis sp. O. aureaus and O. niloticus were clustered together firstly.

MyoD Sequence analysis Cloning Red Tilmpa（Oreochromis sp.）

2014-04-16

農(nóng)業(yè)部水生動(dòng)物遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放研究基金項(xiàng)目（BM2007-02），中國水產(chǎn)科學(xué)研究院水產(chǎn)種質(zhì)資源與養(yǎng)殖技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（2006A003）

郭奕惠，女，助理研究員，研究方向：魚類功能基因；E-mail：yihuiguoedith@163.com

喻達(dá)輝，男，博士，研究員，研究方向：分子遺傳育種；E-mail：pearlydh@163.com