張 佳，閆 敬，戴 夢，任志紅

（華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050015）

夫西地酸是由丹麥利奧制藥公司于1962年首次從脂球真菌（Fusidium coccineum fungus）中提取出來的。夫西地酸在國外廣泛應用50余年，對多種細菌敏感但卻極少出現(xiàn)耐藥［1－2］，具有其它抗生素所沒有的抑菌殺菌和抗炎免疫調(diào)節(jié)的雙重特性。其獨特的抗菌機理是：通過干擾延長因子G、阻斷核糖體易位來抑制細菌蛋白質(zhì)的合成［3］，從而避免與其它抗生素的交叉耐藥性［4］。

作者在此采用常壓室溫等離子體（ARTP）射流誘變和紫外（UV）照射對夫西地酸生產(chǎn)菌進行復合物理誘變［5］，并針對高產(chǎn)突變菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮源的均勻設(shè)計優(yōu)化［6］，以更有效地提高夫西地酸產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 菌株與培養(yǎng)基

出發(fā)菌株FA－30，自行保存。

分離與斜面培養(yǎng)基：酵母粉0.6%，麥芽粉2%，葡萄糖0.6%，碳酸鈣2%，瓊脂2%，pH值7.0。

活化培養(yǎng)基：酵母粉0.6%，麥芽粉2%，葡萄糖0.6%，碳酸鈣2%，pH值7.0。

母瓶培養(yǎng)基：葡萄糖1%，糊精2%，七水合硫酸鎂0.1%，磷酸氫二鉀0.06%，蛋白胨0.5%，酵母粉0.6%，碳酸鈣0.2%，pH值7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：糊精1.8%，花生餅粉1.5%，蛋白胨0.5%，氯化銨0.3%，七水合硫酸鎂0.3%，硫酸鉀0.6%，碳酸鈣1%，pH值7.2。

1.2 方法

1.2.1 種子斜面培養(yǎng)

將保存的出發(fā)菌株液氮管轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，25℃下培養(yǎng)7d后備用。

1.2.2 常壓室溫等離子體射流誘變與紫外照射復合誘變

將出發(fā)菌株斜面以無菌蒸餾水10mL刮下孢子制成孢子液，用玻璃珠打散后取10μL涂布于直徑為0.5cm的不銹鋼反應鋼片上，反應距離為2mm，注入氦氣（流量10L·min－1），100W處理5min。然后用1mL無菌蒸餾水洗滌鋼片，將所得菌液接入10mL活化培養(yǎng)基25℃下活化24h后，以過濾吸管取4mL活化菌孢子液進行紫外誘變（誘變條件為15W、36 cm、1min），將紫外誘變后的孢子液稀釋，以不同梯度涂布于分離培養(yǎng)基平皿中，25℃下培養(yǎng)5～7d。

1.2.3 斜面與搖瓶培養(yǎng)

用接種針挑選單個菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，25℃下培養(yǎng)7d后將斜面上的孢子接種于母瓶培養(yǎng)基中，于25℃、220r·min－1搖床培養(yǎng)36h。待母瓶長成后以5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25℃、220r ·min－1搖床培養(yǎng)120h后，放瓶，采用高效液相色譜法測定發(fā)酵效價（μg·mL－1），挑選相對高產(chǎn)菌株。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮源的優(yōu)化

針對篩選得到的高產(chǎn)菌株，運用均勻設(shè)計實驗對發(fā)酵培養(yǎng)基的碳、氮源進行優(yōu)化。以糊精、花生餅粉、蛋白胨、氯化銨為基礎(chǔ)碳、氮源，考察不同碳、氮源對相對發(fā)酵效價（基于出發(fā)菌株FA－30）的影響，以得到更加優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基配方。應用軟件為均勻設(shè)計V4.0。

2 結(jié)果與討論

2.1 誘變育種結(jié)果

夫西地酸生產(chǎn)菌經(jīng)常壓室溫等離子體射流誘變與紫外照射復合誘變后自分離培養(yǎng)皿中得到276個菌落，接斜面后，經(jīng)多次搖瓶篩選得到3株高產(chǎn)突變菌株AU－15、AU－37、AU－88，平均發(fā)酵效價較出發(fā)菌株FA－30提高14%，其中突變菌株AU－37的發(fā)酵效價提高17%。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

針對誘變篩選得到的突變高產(chǎn)菌株AU－37進行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。以糊精（X1）、花生餅粉（X2）、蛋白胨（X3）、氯化銨（X4）為自變量，相對發(fā)酵效價（Y）為因變量，進行均勻設(shè)計實驗。均勻設(shè)計實驗的因素與水平見表1。

采用最優(yōu)回歸子集法得到相對發(fā)酵效價（Y）與4個因素的回歸方程：Y＝31.3418829＋153.8538016 X1－426.4993159 X3－62.9280683 X21＋267.2214172 X1X3＋556.6651815 X22－176.6655414 X23，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9988。

對回歸方程的各項參數(shù)進行方差分析，結(jié)果見表2。

表1 均勻設(shè)計實驗的因素與水平／%Tab.1 Factors and levels of uniform design experiment／%

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

由表2可知，P值和相關(guān)系數(shù)R2值均在合理范圍，符合統(tǒng)計學要求，說明方程擬合度高，具顯著意義。

糊精、花生餅粉、蛋白胨、氯化銨對相對發(fā)酵效價的影響見圖1。

圖1 糊精（a）、花生餅粉（b）、蛋白胨（c）、氯化銨（d）對相對發(fā)酵效價的影響Fig.1 Effects of dextrin（a），peanut cake powder（b），peptone（c）and ammonium chloride（d）on relative fermentation potency

由圖1可知：糊精、蛋白胨均在實驗選取范圍內(nèi)得到最優(yōu)解；花生餅粉對相對發(fā)酵效價有明顯的促進作用，但由于花生餅粉含量過高會使發(fā)酵液過于黏稠，不建議繼續(xù)增大濃度，即選擇最大值作為最優(yōu)解；氯化銨對相對發(fā)酵效價影響最小，直接選取最大值作為最優(yōu)解。因此，所得最優(yōu)解為：X1＝1.8609%、X2＝ 2.5000%、X3＝0.3000%、X4＝0.5000%，此時Y＝139.85532%。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化配方的驗證

按照均勻設(shè)計實驗得到的優(yōu)化配方進行3批平行實驗，其相對發(fā)酵效價分別為112.2%、116.7%、114.3%，平均相對發(fā)酵效價為114.4%，即發(fā)酵效價較用初始配方發(fā)酵的突變菌株AU－37提高14.4%，較出發(fā)菌株FA－30提高33.8%。且指標優(yōu)于實驗設(shè)計中任一配方。

最終得到的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化配方為：糊精1.86%、花生餅粉2.5%、蛋白胨0.3%、氯化銨0.5%、七水合硫酸鎂0.3%、硫酸鉀0.6%、碳酸鈣1%、pH值7.2。

3 結(jié)論

利用常壓室溫等離子體射流誘變和紫外照射對夫西地酸生產(chǎn)菌株FA－30進行復合誘變，經(jīng)多次篩選得到了較出發(fā)菌株發(fā)酵效價提高17%的突變菌株AU－37，并采用均勻設(shè)計實驗對菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到優(yōu)化配方為：糊精1.86%、花生餅粉2.5%、蛋白胨0.3%、氯化銨0.5%、七水合硫酸鎂0.3%、硫酸鉀0.6%、碳酸鈣1%、pH值7.2。AU－37以此配方進行發(fā)酵的發(fā)酵效價較初始配方提高14.4%，較出發(fā)菌株FA－30提高33.8%，表明，常壓室溫等離子體射流誘變和紫外照射復合誘變是選育夫西地酸高產(chǎn)菌株的有效手段，而將此手段與均勻設(shè)計相結(jié)合，可以使菌種選育效率最大化。

［1］ COLLIGNON P，TURNIDGE J.Fusidic acid in vitro activity［J］.Int J Antimicrob Agents，1999，12（S1）：45－58.

［2］ TURNIDGE J.Fusidic acid pharmacology，pharma cokinetics and pharmacodynamics［J］.Int J Antimicrob Agents，1999，12（S2）：23－34.

［3］ 陸一鳴，望亭松.夫西地酸國外應用現(xiàn)狀及進展［J］.中國感染控制雜志，2002，（1）：71－74.

［4］ WILKINSON J D.Fusidic acid in dermatology［J］.Br J Dermatol，1998，139（S 53）：37－40.

［5］ 龐德欽，周蓬蓬，魯明波，等.等離子體－紫外線復合誘變選育高產(chǎn)谷胱甘肽酵母菌［J］.生命科學研究，2007，11（3）：238－241.

［6］ 關(guān)亞鵬，婁忻，張莉，等.均勻設(shè)計法優(yōu)化咪唑立賓發(fā)酵培養(yǎng)基配方［J］.中國抗生素雜志，2008，33（8）：471－473.