夏　虹　梁耀軍　何　靜　鮑文朵娜　周顯光　張明超　劉志紅　施少林

Toll樣受體(TLR)是一類識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(PAMP)的受體家族，主要分布于免疫細(xì)胞，在人體由10個(gè)成員組成。TLR結(jié)合配體后，通過(guò)MyD88依賴途徑或MyD88非依賴途徑進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。經(jīng)典的MyD88依賴途徑主要通過(guò)TIR結(jié)構(gòu)域的作用使MyD88活化并招募絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4(IRAK4)，促使IRAK4介導(dǎo)的IRAK1發(fā)生磷酸化。IRAK1磷酸化后繼續(xù)招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)[1-3]，TRAF6激活后誘導(dǎo)兩種不同的信號(hào)通路：一方面最終激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)，導(dǎo)致一系列炎癥因子的產(chǎn)生[如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素12(IL-12)等[1,4,5]]；另一方面通過(guò)旁路信號(hào)途徑激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，主要有蛋白激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK)及p38 MAPK組成[6]。TLR9比較特殊，存在于內(nèi)體膜上[7]，其配體通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后在內(nèi)體與TLR9結(jié)合并激活TLR9信號(hào)通路，從而活化免疫細(xì)胞，發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)。病毒和細(xì)菌中的非甲基化CpG-DNA是TLR9的天然配體，近年來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)，一些內(nèi)源性物質(zhì)也可通過(guò)TLR9發(fā)揮免疫活性作用，如氧化型DNA[8]、線粒體DNA(mtDNA)[9,10]、富含低甲基化CpG-DNA免疫復(fù)合物等[11-15]。

足細(xì)胞是重要的腎臟固有細(xì)胞，足細(xì)胞損傷引起的腎小球?yàn)V過(guò)屏障通透性改變和蛋白尿的產(chǎn)生被認(rèn)為是腎小球硬化發(fā)生發(fā)展的中心始動(dòng)因素[16]。研究表明，NF-κB在足細(xì)胞損傷產(chǎn)生蛋白尿的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[17,18]；p38 MAPK信號(hào)通路激活后參與足細(xì)胞損傷和凋亡[19,20]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，TLR9在狼瘡型腎病等疾病狀態(tài)下的足細(xì)胞從無(wú)到有的表達(dá)[21]，而TLR9能激活NF-κB和p38 MAPK，這提示TLR9可能參與了這些疾病的足細(xì)胞的損傷。

嘌呤霉素氨基核苷(PAN)可引起大鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)腎病綜合征，是經(jīng)典的腎小球微小病變動(dòng)物模型的造模藥物。目前認(rèn)為PAN可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物足細(xì)胞足突融合，造成非免疫因素介導(dǎo)的[22,23]、單純足細(xì)胞病變[24]。以PAN處理體外培養(yǎng)的足細(xì)胞，可導(dǎo)致足細(xì)胞內(nèi)NF-κB和p38 MAPK信號(hào)通路的激活[19,25]，并引起足細(xì)胞骨架排列紊亂、凋亡等變化[26,27]，因而是研究足細(xì)胞損傷機(jī)制的理想模型。

近期我們發(fā)現(xiàn)，PAN能上調(diào)體外培養(yǎng)的足細(xì)胞中TLR9的表達(dá)。鑒于TLR9信號(hào)能激活NF-κB和p38 MAPK，我們提出TLR9可能參與了PAN對(duì)足細(xì)胞的損傷作用。本研究利用若干分子生物學(xué)手段證明了該假說(shuō)，從而揭示了足細(xì)胞損傷的一個(gè)新的分子機(jī)制。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡Wistar雄性大鼠，體重140～160g，清潔級(jí)(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

材料

主要試劑永生化的人足細(xì)胞株(HPC)由英國(guó)Bristol大學(xué)Moin.A.Saleem教授惠贈(zèng)；完全培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素各100 U/ml(美國(guó)Gibco)及1% Insulin-Transferrin-Selenium(Invitrogen公司)。其他試劑包括18s rRNA、人的TLR9、IRAK1、TRAF6、IL-12等引物、細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000及質(zhì)粒DNA提取試劑盒(PureLink? HiPure Plasmid DNA Purification Kits)(均購(gòu)自Invitrogen公司)；總p65及p38 MAPK蛋白抗體、磷酸化p65及p38 MAPK抗體(美國(guó)Cell Signaling Technologies)；TLR9和CD2AP抗體(Abcam)；PAN和podocin抗體(Sigma)；Alexa Fluor? 647 Annexin V和Propidium Iodide Solution(Biolegend)； 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒DRR037A和定量PCR試劑DRR820A(Takara)；RIPA、BCA蛋白測(cè)定試劑盒(上海碧云天公司)；抗兔二抗(Bioworld)、GAPDH抗體(Kangchen)、psiRNA-hTLR9(si-TLR9)質(zhì)粒(Invivogen)；RNA提取試劑盒(Ambion)；E.coli DH5a 感受態(tài)細(xì)菌(北京全式金公司)。

方法

足細(xì)胞培養(yǎng)在5% CO2及飽和濕度條件下，足細(xì)胞先于33℃進(jìn)行增殖，然后在37℃培養(yǎng)10～14d。處理細(xì)胞前先血清饑餓12h。以PBS和25～100 μg/ml的PAN刺激3h、6h、12h、24h或48h，然后收集細(xì)胞分別用于免疫印跡分析、定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)基因表達(dá)檢測(cè)和凋亡的流式細(xì)胞分析。

PAN腎病模型建立取6周齡雄性Wistar大鼠，體重140～160g，采用單次頸靜脈注射法，將4 mg/100g體重劑量的PAN，從左側(cè)頸靜脈靜脈注入，5 min內(nèi)完成注射完畢。對(duì)照組動(dòng)物同法注射相同劑量的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)設(shè)立對(duì)照組(n=8)和試驗(yàn)組(n=8)，注射后20d處死大鼠。

Western Blot印跡檢測(cè)25 cm2培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞在處理完成后，以預(yù)冷的PBS液洗滌，加入150 μl預(yù)冷RIPA(Radio Immunopreciprtation Assay)裂解液(按1 ml裂解液加40 μl的25×蛋白酶抑制劑、100 μl的10×磷酸酶抑制劑)，冰浴30 min，刮勺收集樣本，4℃下11 500 r/min離心15 min，取上清，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。細(xì)胞裂解液加入上樣緩沖液后煮沸變性；樣品經(jīng)10%或8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，使用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(電壓10V，30～50 min)。將膜浸入含5%脫脂牛奶的TBST溶液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.14，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween20)，室溫孵育60 min；加入一抗(兔抗p65和抗磷酸化pp65，1∶1 000；兔抗p38和pp38，1∶1 000；鼠抗TLR9，1∶1 000；兔抗podocin，1∶1 000；兔抗CD2AP，1∶1 000)，于4 ℃孵育過(guò)夜；經(jīng)TBST洗滌3次(10 min/次)后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠二抗(1∶15 000)，室溫孵育1h；經(jīng)TBST洗滌后，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL，Millipore)顯色，在GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)照相掃描蛋白條帶的吸光度并分析處理。

qRT-PCR檢測(cè)TLR9、IL-12的表達(dá)水平收集足細(xì)胞，總RNA按Ambion試劑盒方法提取并用Nanodrop測(cè)定純度和濃度，再使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TakaRa，DRR037A)進(jìn)行cDNA合成。qRT-PCR引物為人TLR9：5′-CCGTGACAATTACCTGGCCTTC-3′和5′-CAGGGCCTTCAGCTGGTTTC-3′。IL-12：5′-GGCCGTCAGCAACATGCTCCA-3′和5′-GGCACAGGGCCATCATAAAAGAGGT-3′。IRAK1:5′-CCACCCCAGTTCTATCATACTCC-3′和5′-GGCCAACAAGGTTACAGACTT-3′。TRAF6：5′-TTTGCTCTTATGGATTGTCCCC-3′和5′-CATTGATGCAGCACAGTTGTC-3′。參照物18s rRNA：5′-TTCTCGATTCCGTGGGTGG和5′-AGCATGCCAGAGTCTCGTTC。qPCR使用SYBR Green 法，qRT-PCR熱循環(huán)條件：95℃ 30s預(yù)變性后，進(jìn)行95℃ 5s、60℃ 30s的熱循環(huán)，共40次；使用儀器為ABI 7900HT Fast Real time System。讀取臨界循環(huán)數(shù)(CT)進(jìn)行記錄分析。以正常對(duì)照細(xì)胞為矯正樣本，用比較閾值法計(jì)算目的基因的相對(duì)含量(2-△△ct)。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡采用膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶(AnnexinV/PI)雙染的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PAN 誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。收集接種于六孔板的各組細(xì)胞，用PBS 洗2遍；按試劑盒(Biolegend)方法，用400 μl-1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，濃度大約為1×106個(gè)/ml，在細(xì)胞懸浮液中加入Alexa Fluor 647 AnnexinV 和PI，輕輕混勻后室溫避光條件下孵育10～15 min，在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀(型號(hào)FACS ARIA，BD公司)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

大鼠腎組織免疫組化染色取石蠟包埋的組織切片，經(jīng)過(guò)二甲苯→二甲苯→無(wú)水乙醇→95%乙醇→75%乙醇進(jìn)行脫蠟復(fù)水處理后，用蒸餾水清洗3遍，0.3%過(guò)氧化氫處理15 min，經(jīng)微波處理后，用10%小牛血清孵育10 min，加入TLR9抗體(1∶50)，4 ℃孵育過(guò)夜；經(jīng)PBS洗滌5 min，加入二抗，室溫孵育30 min，再進(jìn)行DAB顯色(約2 min，但以鏡下觀察為準(zhǔn))；經(jīng)蘇木素復(fù)染3 min，用中性樹(shù)膠(Sigma，St.Louis，MO)封片，置顯微鏡(Cannon，Japan)下觀察。

TLR9干擾后對(duì)足細(xì)胞損傷的影響使用Lipofectamine 2000將si-TLR9和對(duì)照質(zhì)粒psiRNA-h7SK(si-NC)轉(zhuǎn)染足細(xì)胞(密度約80%)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行；轉(zhuǎn)染24h后加入PAN處理24h，收集細(xì)胞分別用于qRT-PCR，Western Blot印跡，流式細(xì)胞分析等，以確定TLR9抑制對(duì)PAN損傷作用的影響。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

結(jié)　　果

PAN上調(diào)足細(xì)胞中TLR9信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)與正常對(duì)照組相比，經(jīng)50 μg/ml PAN刺激的足細(xì)胞，其TLR9的mRNA水平顯著增加(P<0.05)(圖1A)，蛋白表達(dá)也相應(yīng)增加(圖1B、C)。 此外，TLR9信號(hào)通路中的兩個(gè)組分IRAK1和TRAF6的mRNA水平明顯上調(diào)(圖1D)， 蛋白水平相應(yīng)上調(diào) (圖1E、F)。

PAN上調(diào)NF-κB和p38 MAPK磷酸化水平以不同濃度PAN(0、25 μg/ml、50 μg/ml)處理足細(xì)胞24h， 與正常對(duì)照組相比，pp38隨著PAN濃度增加而增加(圖2A)； 用50 μg/ml的PAN處理足細(xì)胞不同時(shí)間(0、6h、12h、24h)發(fā)現(xiàn),6h時(shí)p65磷酸化就已經(jīng)增加，并持續(xù)至24h(圖2B)。同時(shí)，NF-κB信號(hào)通路下游的炎癥因子IL-12的表達(dá)也發(fā)生了改變，即與對(duì)照組相比，PAN刺激組的IL-12 mRNA在12h和24h均顯著上調(diào)(圖2C)。

圖1　PAN上調(diào)足細(xì)胞中TLR9信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)

圖2　PAN激活NF-κB和p38 MAPK信號(hào)通路

圖3　PAN下調(diào)足細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)并增加細(xì)胞凋亡

PAN下調(diào)足細(xì)胞標(biāo)記物并誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡以50 μg/ml PAN處理足細(xì)胞不同時(shí)間(0、3h、6h、12h、24h、48h)，Western Blot印跡分析顯示，足細(xì)胞標(biāo)記物podocin和CD2AP從3h開(kāi)始表達(dá)逐漸減低(圖3A、3B)。此外，隨PAN濃度增加(0、25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml)podocin和CD2AP蛋白水平呈逐漸降低趨勢(shì)(圖3C、D)。足細(xì)胞凋亡率隨著PAN濃度增加而增加(圖3E、F)；以50 μg/ml PAN處理足細(xì)胞不同時(shí)間(0、6h、12h、24h),與正常對(duì)照組相比，25 μg/ml的PAN即可顯著促進(jìn)足細(xì)胞凋亡(P<0.01)，而100 μg/ml的PAN能更顯著提高足細(xì)胞的凋亡率(與25 μg/ml濃度相比，P<0.01； 圖3E、F)。與正常對(duì)照組比較，PAN 處理足細(xì)胞6h的凋亡率為7.53%±0.29%，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.059)；而在PAN刺激12h時(shí)，約8.40%±0.23%的足細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；在24h和48h時(shí)間點(diǎn)，凋亡率進(jìn)一步提高增加(24h，P<0.05；48h，P<0.01)，但48h與24h的凋亡率無(wú)明顯變化(P=0.873)(圖3G、H)。這些結(jié)果證明PAN能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的足細(xì)胞發(fā)生損傷，是一個(gè)理想的足細(xì)胞損傷模型。

PAN上調(diào)大鼠足細(xì)胞TLR9的表達(dá)為了解TLR9信號(hào)通路是否參與PAN誘導(dǎo)的大鼠足細(xì)胞損傷，我們檢測(cè)了TLR9在PAN大鼠足細(xì)胞的表達(dá)。免疫組化結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，PAN組大鼠腎小球中的TLR9染色強(qiáng)度明顯增高(圖4A)。我們用篩網(wǎng)過(guò)濾法得到PAN大鼠和正常大鼠的腎小球，提取總RNA后，進(jìn)行qRT-PCR分析顯示，與正常對(duì)照組相比，PAN大鼠腎小球中TLR9的mRNA水平顯著增加(P<0.05)(圖4B)。這提示TLR9信號(hào)通路的激活可能在多種腎損傷模型中存在，而且提示PAN大鼠可能是研究TLR9在足細(xì)胞損傷中作用的合適活體模型。

足細(xì)胞TLR9干擾能減弱PAN活化NF-κB和p38及上調(diào)IL-12表達(dá)的效應(yīng)將足細(xì)胞轉(zhuǎn)染TLR9干擾psiRNA-hTLR9質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒，qRT-PCR結(jié)果顯示，TLR9干擾組細(xì)胞(si-TLR9)中TLR9 mRNA 水平較對(duì)照組(si-NC)明顯降低(P<0.05，圖5A)。此外，足細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，給予或不給予PAN(50 μg/ml)刺激，再提取蛋白進(jìn)行TLR9免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，PAN增加si-NC組細(xì)胞(si-NC+PAN)TLR9表達(dá)，但PAN處理si-TLR9組細(xì)胞(si-TLR9+PAN)時(shí)，TLR9的增加幅度明顯小于si-NC+PAN組(圖5B)。 以上結(jié)果表明TLR9干擾質(zhì)粒成功減低了TLR9 mRNA和蛋白的表達(dá)。

我們對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行了NF-κB和p38的活性的檢測(cè)。si-TLR9+PAN組與si-NC+PAN組相比，p38磷酸化水平和NF-κB p65磷酸化水平均明顯降低(圖5C、D)。因此，在足細(xì)胞PAN損傷模型中，TLR9干擾能抑制p38和NF-κB信號(hào)通路。為進(jìn)一步證明，我們檢測(cè)下游炎癥因子IL-12的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，PAN顯著上調(diào)si-NC+PAN組細(xì)胞的IL-12 mRNA(與si-NC組相比，P<0.05，圖5E)；而TLR9干擾能顯著減弱PAN對(duì)IL-12 mRNA的誘導(dǎo)作用(si-NC+PAN組與si-TLR9+PAN組相比，P<0.05，圖5E)。

圖4　PAN誘導(dǎo)上調(diào)大鼠腎組織TLR9表達(dá)

圖5　足細(xì)胞TLR9干擾對(duì)NF-κB和p38磷酸化水平及IL-12表達(dá)的影響

TLR9干擾能減輕PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡將足細(xì)胞轉(zhuǎn)染TLR9干擾質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒并經(jīng)PAN(50 mg/ml)處理24 h 后，進(jìn)行Annexin V染色和流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，PAN顯著增加si-NC+PAN組細(xì)胞的凋亡 (si-NC+PAN與si-NC組相比，P<0.01,圖6A)；而TLR9干擾能消除PAN誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，即與si-NC+PAN組相比，si-TLR9+PAN組足細(xì)胞凋亡率明顯減低(P<0.01)， 且與si-NC及si-TLR9組細(xì)胞的凋亡率無(wú)顯著差別(圖6A)。代表性的流式細(xì)胞分析結(jié)果見(jiàn)圖6B。

圖6　TLR9干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響

討　　論

足細(xì)胞位于腎小球基膜(GMB)外側(cè)，相鄰的足細(xì)胞之間通過(guò)裂隙膜緊密相連，構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)的關(guān)鍵屏障[28]。足細(xì)胞功能的降低、損傷及丟失是導(dǎo)致各種腎小球疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[29]。研究足細(xì)胞對(duì)損傷刺激的應(yīng)答，尋找保護(hù)足細(xì)胞的新途徑對(duì)于治療腎臟疾病或者延緩腎臟病進(jìn)展至關(guān)重要。在這類研究中，通常需要借助各種損傷模型，包括若干藥物誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的模型，研究足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，從而確定保護(hù)或治療足細(xì)胞的分子靶點(diǎn)。

PAN誘導(dǎo)的腎臟損傷模型被認(rèn)為能模擬微小病變(MCD)和局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)，并以足細(xì)胞損傷為其突出特征，常表現(xiàn)為足突融合、足細(xì)胞凋亡、足細(xì)胞減少等。已有研究證明PAN造成的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激是足細(xì)胞損傷產(chǎn)生蛋白尿的重要因素[30,31]。給予氧自由基清除劑預(yù)處理后，同樣PAN刺激，足細(xì)胞的受損程度得到部分緩解[31,32]。Marshall等[33]發(fā)現(xiàn)，PAN介導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧能夠直接導(dǎo)致 DNA損傷，上調(diào)了特異性的細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。此外，還有研究證實(shí)PAN刺激足細(xì)胞時(shí)能激活NF-κB和p38 MAPK信號(hào)通路[25,34]，足細(xì)胞內(nèi)NF-κB上調(diào)能導(dǎo)致腎小球腎炎和蛋白尿[18]，而抑制腎小球腎炎模型足細(xì)胞的NF-κB 信號(hào)通路，能減輕足細(xì)胞損傷和蛋白尿[17]。足細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK激活與細(xì)胞骨架完整性改變和凋亡密切相關(guān)[19,20]，p38 MAPK的抑制劑能有效防止足細(xì)胞標(biāo)志物的減少和蛋白尿發(fā)生。這些研究提示NF-κB和p38 MAPK信號(hào)可能介導(dǎo)PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。

圖7　足細(xì)胞中TLR1、TLR2、TLR4和TLR7的表達(dá)分析

眾所周知，TLR信號(hào)在哺乳動(dòng)物的固有或適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，是聯(lián)系先天免疫和后天免疫的橋梁。免疫細(xì)胞中TLR9信號(hào)通路激活通?？梢鹣掠蜰F-κB 和p38 MAPK信號(hào)通路活化，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子。與活體足細(xì)胞不同，已有研究證明體外培養(yǎng)的足細(xì)胞表達(dá)TLR9[35]。本研究也證實(shí)了這一結(jié)果，而且我們還發(fā)現(xiàn)，PAN處理足細(xì)胞能上調(diào)TLR9的表達(dá)，且成時(shí)間和濃度依賴性；用PAN處理足細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比PAN組的NF-κB和p38 MAPK信號(hào)得以激活，p65和p38的蛋白磷酸化水平明顯上調(diào)，這些結(jié)果均提示除了氧化應(yīng)激，TLR9可能是PAN導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的又一機(jī)制。為了證明TLR9信號(hào)參與了PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，我們利用RNA干擾技術(shù)降低足細(xì)胞TLR9表達(dá)發(fā)現(xiàn)，TLR9抑制可降低PAN引起的NF-κB 和p38磷酸化、并減少足細(xì)胞凋亡，從而驗(yàn)證了我們的假說(shuō)。我們也進(jìn)行了足細(xì)胞TLR9過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NF-κB 和p38磷酸化及足細(xì)胞凋亡并不能進(jìn)一步增強(qiáng)，這可能提示我們所使用的足細(xì)胞系，其TLR9含量已達(dá)飽和，使配體能被充分利用，因而外源TLR9的過(guò)表達(dá)并不能增強(qiáng)TLR9信號(hào)。

上文中已經(jīng)提到PAN處理足細(xì)胞能上調(diào)TLR9的表達(dá)，并成時(shí)間和濃度依賴性，但具體的機(jī)制尚不清楚。研究表明在其他的疾病中(例如動(dòng)脈粥樣硬化)，內(nèi)皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激的產(chǎn)物氧化低密度脂蛋白能夠通過(guò)誘導(dǎo)自噬和mtDNA損傷最終增加TLR9的表達(dá)[36,37]。目前我們已經(jīng)知道PAN能夠造成足細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，可能類似的機(jī)制也存在于足細(xì)胞中，最終導(dǎo)致足細(xì)胞內(nèi)TLR9的上調(diào)[38]。

免疫細(xì)胞中除了TLR9，其他TLRs分子激活后同樣能通過(guò)MyD88依賴途徑或MyD88非依賴途徑引起下游NF-κB 和p38 MAPK信號(hào)通路活化。近年來(lái)研究表明體外培養(yǎng)的足細(xì)胞也不同程度地表達(dá)TLRs，比如TLR1～6[35]、TLR10；此外，PAN處理足細(xì)胞可導(dǎo)致TLR2～6的表達(dá)不同程度地增加，并能夠誘導(dǎo)NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)移[25]。本研究證實(shí)除了TLR9，足細(xì)胞還組成性表達(dá)TLR1、TLR2、TLR4和TLR7，予PAN處理后TLR4和TLR7的mRNA水平顯著增加(圖7)，因而TLR4和TLR7也可能參與了NF-κB 和p38 MAPK的激活。為確定TLR9的作用，我們進(jìn)行了TLR9干擾，發(fā)現(xiàn)PAN引起的NF-κB 和p38磷酸化和細(xì)胞凋亡能被顯著減輕，證明TLR9確實(shí)參與了PAN對(duì)足細(xì)胞的損傷作用。

在PAN處理的足細(xì)胞中，我們注意到TLR9下游的分子變化似乎早于TLR9的上調(diào)。可能的原因是，本研究中所使用的足細(xì)胞系均能檢測(cè)到TLR9 mRNA及蛋白的表達(dá)，因而PAN的處理可能立刻產(chǎn)生TLR9配體，并與已經(jīng)存在的TLR9結(jié)合并激活其信號(hào)通路，引起下游分子的變化。后續(xù)由PAN誘導(dǎo)的TLR9應(yīng)該能進(jìn)一步增強(qiáng)該信號(hào)和下游分子的變化。目前，我們猜測(cè)PAN能損傷線粒體，引起線粒體的自噬，從而使mtDNA(TLR9的可能配體)被帶入內(nèi)體/溶酶體，結(jié)合并激活其中的TLR9。

本研究中我們觀察到PAN處理足細(xì)胞能夠引起TLR9激活這一現(xiàn)象，但與TLR9相互作用的配體仍不明確。TLR9的天然配體是病毒和細(xì)菌中的非甲基化CpG-DNA，但新近研究發(fā)現(xiàn)TLR9也能夠識(shí)別個(gè)體自身mtDNA。研究表明，在創(chuàng)傷或出血性休克情況下，損傷組織釋放的mtDNA能夠通過(guò)與TLR9相互作用刺激中性粒細(xì)胞并激活固有免疫反應(yīng)[39]。除了細(xì)胞外mtDNA，有研究認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)的mtDNA也可作用于TLR9的配體，比如逃避了自噬作用的mtDNA可通過(guò)TLR9參與心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)并促進(jìn)心肌炎及擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生和發(fā)展[10]。線粒體來(lái)源于細(xì)菌，mtDNA與細(xì)菌DNA具有相似性，含有非甲基化CpG基序。這些研究提示在足細(xì)胞PAN損傷模型中，PAN可能損傷線粒體并釋放mtDNA，該mtDNA可能成為T(mén)LR9配體，激活TLR9信號(hào)，促進(jìn)足細(xì)胞損傷。不過(guò)該假說(shuō)有待于實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。

有研究表明TLR9在正常小鼠足細(xì)胞中不表達(dá)[40]。Machida等[21]也證明正常人腎臟固有細(xì)胞同樣不表達(dá)TLR9，但幼年狼瘡患者足細(xì)胞存在TLR9高表達(dá)，并且TLR9也表達(dá)于其他足細(xì)胞病的部分患者，如MCD和FSGS等。此外，Batsford等[41]發(fā)現(xiàn)在其他疾病中，TLR9表達(dá)于腎小球固有細(xì)胞，比如多瘤病毒感染和溶血尿毒綜合征。這些研究提示TLR9可能參與足細(xì)胞損傷過(guò)程。由于我們發(fā)現(xiàn)TLR9在的PAN足細(xì)胞損傷模型表達(dá)上調(diào)，因此，PAN的足細(xì)胞損傷模型可能是研究TLR9是否參與足細(xì)胞損傷的理想工具。本研究結(jié)果證明，TLR9通過(guò)NF-κB和p38 MAPK信號(hào)通路，介導(dǎo)了PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。提示TLR9在多種腎臟疾病中的足細(xì)胞表達(dá)可能促進(jìn)了足細(xì)胞損傷，因而TLR9可能是這些腎臟病治療的潛在靶點(diǎn)。

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