付　佳　何慈江　劉志紅

足細(xì)胞是腎小球中具有重要功能的一類細(xì)胞，足細(xì)胞損傷參與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程。闡明足細(xì)胞損傷及修復(fù)機(jī)制是當(dāng)今腎臟病研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。然而，目前足細(xì)胞研究大多采用體外培養(yǎng)的足細(xì)胞系，由于體外細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境可改變細(xì)胞生物學(xué)特性，因而并不能客觀的反應(yīng)其在體內(nèi)的實(shí)際狀態(tài)，限制了對(duì)足細(xì)胞的研究[1]。由此，近年來更多的研究致力于尋找從動(dòng)物體內(nèi)提取足細(xì)胞的方法。為彌補(bǔ)現(xiàn)有的技術(shù)因不能獲得滿足基因組學(xué)研究水平的產(chǎn)量和純度而未得到廣泛應(yīng)用的不足[2,3]，基于流式細(xì)胞儀的熒光激活細(xì)胞分選(FACS)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

流式細(xì)胞儀是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的高效檢測(cè)儀器，提供生物粒子大小、結(jié)構(gòu)及熒光強(qiáng)度等信息。其應(yīng)用范圍非常廣泛，其中細(xì)胞分選技術(shù)就是它的重要應(yīng)用之一。細(xì)胞分選技術(shù)可根據(jù)細(xì)胞的特性將其從混合樣品中分離出來，目前常用的分選技術(shù)包括單細(xì)胞分選(IsoRaft Array，DEP Array)、密度梯度離心法、免疫磁珠法及流式分選法(FACS)。與傳統(tǒng)分選方法相比，流式分選法具有極高的精確度和速度，可同時(shí)進(jìn)行陰性和陽性選擇，甚至多路分選，且不受限于表面抗原，可根據(jù)任何能檢測(cè)到的發(fā)光度(如細(xì)胞體積)或熒光(DNA、RNA或蛋白含量，酶活性，特異抗原)散射度差異來分離細(xì)胞[4]。流式細(xì)胞儀通過極細(xì)的鞘液包裹推動(dòng)單細(xì)胞/微粒排成單列待測(cè)細(xì)胞經(jīng)過流動(dòng)室噴口后斷裂為均勻液滴，根據(jù)每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過待測(cè)點(diǎn)時(shí)光信號(hào)的變化來判斷該細(xì)胞的大小、形態(tài)及熒光強(qiáng)度，并充以正、負(fù)不同的電荷，使其流經(jīng)偏轉(zhuǎn)板時(shí)可在高壓電場(chǎng)的作用下偏轉(zhuǎn)，分選入各自的收集容器，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。

國內(nèi)現(xiàn)有的細(xì)胞分選技術(shù)主要應(yīng)用于培養(yǎng)的細(xì)胞系，對(duì)于制備新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液尚無廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用的熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因小鼠具有在特定組織或細(xì)胞類型中穩(wěn)定表達(dá)熒光的轉(zhuǎn)基因株，相較于傳統(tǒng)動(dòng)物模型，可在發(fā)育的各個(gè)時(shí)期及不同疾病狀態(tài)下方便地觀察到熒光標(biāo)記細(xì)胞，避免了應(yīng)用特定表面抗體包被分選細(xì)胞時(shí)抗體效價(jià)低的缺陷，是進(jìn)行活體細(xì)胞分選的理想模式動(dòng)物。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物紅色熒光蛋白報(bào)告基因小鼠(IRG)[B6;C3-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J]及足細(xì)胞特異hNPHS2-Cre重組酶小鼠購于美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室。小鼠飼養(yǎng)于特殊無病原體，自由飲水，飼料為繁殖用固性飼料，SPF 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。12h照明、12h黑暗交替環(huán)境。實(shí)驗(yàn)小鼠均采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行基因型檢測(cè)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照美國生理學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)方法

腎小球提取與制備應(yīng)用Takemoto[2]曾報(bào)道過的磁珠分離法提取8w紅色熒光蛋白報(bào)告基因小鼠腎小球。將小鼠麻醉后置于解剖顯微鏡下，由一側(cè)腎動(dòng)脈緩慢灌注4 ml 37℃預(yù)熱磁珠溶液及1 ml含消化酶的磁珠溶液。取下腎臟后用刀片將其切割至1 mm3大小，加入3 ml 消化液后在37℃孵箱孵育15 min。消化過程中每5 min用槍溫和吹打，加速消化，其后所有操作步驟置于冰上或4℃。消化至無團(tuán)塊組織，取出EP管，消化后腎臟通過100 μm細(xì)胞篩，除去未解離組織，取4℃ HBSS溶液廣泛清洗流經(jīng)分子篩的消化組織，1 500 r/min普通離心5 min。吸去上清及中間磁珠層，僅留下細(xì)胞沉淀，加入2 ml HBSS溶液重懸細(xì)胞。2 ml EP管置于磁性微粒濃縮器，吸去上層清液，HBSS兩次清洗吸附在富集器上的腎小球。

單細(xì)胞懸液制備加入2 ml消化液重懸腎小球，2 000 r/min在37℃恒溫混勻器中孵育40 min。消化過程中，每5 min用移液管溫和吹打混勻，熒光顯微鏡下檢查消化效率。消化后溶液再次置于磁性微粒濃縮器，留取上清液，去除吸附的磁珠及無足細(xì)胞的腎小球剩余結(jié)構(gòu)。取上清液經(jīng)分子篩濾過至50 ml falcon管中，1 500 r/min離心5 min。吸去上層清液，僅留取管底細(xì)胞，最終加500 μl HBSS重懸得到單細(xì)胞懸液用于流式細(xì)胞分選。

熒光激活細(xì)胞分選(FACS)單細(xì)胞懸液中加入二脒基苯基吲哚(DAPI)熒光染色判斷細(xì)胞活力。單細(xì)胞懸液通過BD AriaII在488 nm波長激發(fā)光下分離綠色熒光蛋白陽性(GFP+)和GFP-細(xì)胞。上樣后調(diào)節(jié)細(xì)胞流速始終維持在2 500 events/s 左右。根據(jù)目標(biāo)熒光標(biāo)記細(xì)胞的大小和顆粒度選定Forward Scatter(FSC)和Side Scatter(SSC)范圍。以野生型自發(fā)熒光強(qiáng)度為基準(zhǔn)，確定收集細(xì)胞的熒光強(qiáng)度范圍，設(shè)定僅DAPI陰性細(xì)胞可被分選(380 nm波長激發(fā))。熒光細(xì)胞直接收集至裝有300 μl細(xì)胞裂解液的螺帽管中，每管收集約150 μl 細(xì)胞HBSS 懸液(約3×105個(gè)細(xì)胞)。

RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR在不含RNA酶環(huán)境下經(jīng)苯酚-氯仿法提取RNA，制備過程最后用DNA酶消化處理。RNA經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢后核糖核酸(RIN)指數(shù)在9.5～10范圍用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。提取RNA經(jīng)Ambion WT expression kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA,隨后用MESA FAST qPCR kit進(jìn)行SYBR分析。小鼠nephrin,podocin,synaptopodin,pecam1,cdh5引物序列見表1。

表1　小鼠足細(xì)胞標(biāo)志蛋白引物序列設(shè)計(jì)

結(jié)　　果

IRG報(bào)告基因小鼠熒光表達(dá)情況本實(shí)驗(yàn)所使用的IRG，與Cre重組酶結(jié)合前可在全身各組織廣泛表達(dá)紅色熒光蛋白，而和組織特異性Cre重組酶結(jié)合后則在特定組織表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)[19]。觀察8w 成年IRG小鼠，在熒光顯微鏡下即可見紅色熒光蛋白在全身各組織均有表達(dá)。繼而將此轉(zhuǎn)基因小鼠與hNPHS2-Cre小鼠雜交，利用共聚焦顯微鏡觀察新鮮分離所得腎小球，可見腎小球中同時(shí)有GFP和紅色熒光蛋白表達(dá)(圖1)，其中存在GFP細(xì)胞陽性表達(dá)的腎小球占總量的80%。經(jīng)免疫熒光證實(shí)，腎小球中GFP的表達(dá)與足細(xì)胞標(biāo)志蛋白synaptopodin表達(dá)共定位(圖2)。

圖1　IRG轉(zhuǎn)基因小鼠中熒光蛋白表達(dá)標(biāo)記(8w新鮮分離腎小球，×63)

圖2　腎小球中綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)和足細(xì)胞標(biāo)志蛋白synaptopodin表達(dá)共定位(IF，×63)

綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞分選經(jīng)兩次消化后獲得單細(xì)胞懸液，上樣后根據(jù)流式細(xì)胞儀FSC及SSC參數(shù)選取細(xì)胞集中區(qū)域。首先選取FSC作閾值，排除樣品中各種碎片及鞘液中的小顆粒，避免對(duì)被測(cè)細(xì)胞的干擾及純度影響(圖3A)。其次，通過DAPI免疫熒光強(qiáng)度，鑒定并排除已死亡細(xì)胞(圖3B)。通過綠色熒光(FL-GFP)參數(shù)可知細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)度，與野生型單細(xì)胞懸液樣本對(duì)比可見一群SSC值大且FL-GFP值高的細(xì)胞，即為轉(zhuǎn)基因小鼠中GFP標(biāo)記細(xì)胞(圖3C)。選取該組細(xì)胞即可成功進(jìn)行熒光標(biāo)記細(xì)胞分選，該GFP平均熒光陽性率為14.93%，與所報(bào)道足細(xì)胞占腎小球細(xì)胞比例基本一致。在選取過程中，適當(dāng)提高FL-GFP閾值可避免細(xì)胞自發(fā)熒光對(duì)分選的干擾，進(jìn)一步提高分選純度。

圖3　A：運(yùn)用Forward Scatter(FSC)和Side Scatter(SSC)參數(shù)選取分選細(xì)胞群示例；B：運(yùn)用DAPI熒光值參數(shù)選取活細(xì)胞群示例；C：報(bào)告基因小鼠腎小球中熒光蛋白表達(dá)水平

分選細(xì)胞基因表達(dá)情況鑒定在流式細(xì)胞分選過程中分別收集高熒光信號(hào)和低熒光信號(hào)的細(xì)胞作為對(duì)照，同時(shí)提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用qPCR方法檢測(cè)足細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白nephrin,podocin,synaptopodin及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Pecam1,cadh5表達(dá)情況。結(jié)果可知，在GFP高表達(dá)細(xì)胞中，足細(xì)胞表面標(biāo)記物的mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05),其中synaptopodin表達(dá)明顯增高；而內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物mRNA明顯低于GFP低表達(dá)腎小球細(xì)胞(P<0.001)(圖4)。

討　　論

近十年來對(duì)足細(xì)胞生物學(xué)的研究不斷深入，尤其隨著足細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白分子的相繼發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞已被認(rèn)為是參與各種原發(fā)性或繼發(fā)性腎小球疾病進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞[20]。 足細(xì)胞特異性調(diào)控基因表達(dá)的Cre重組酶與反轉(zhuǎn)四環(huán)素反式作用轉(zhuǎn)錄因子(rtTA)的發(fā)現(xiàn)更加速了對(duì)足細(xì)胞的深入研究。Cre重組酶廣泛存在于大多數(shù)轉(zhuǎn)基因系的細(xì)胞或特定組織中，這使得研究胚胎發(fā)育中某種細(xì)胞的譜系追蹤和特定組織的基因敲除技術(shù)得以廣泛開展。當(dāng)應(yīng)用于譜系追蹤時(shí)，通常將表達(dá)Cre重組酶的譜系與報(bào)告基因譜系雜交，通過誘導(dǎo)表達(dá)Cre重組酶激活報(bào)告基因。

圖4　分選GFP+和GFP-細(xì)胞足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物mRNA表達(dá)情況

目前，已報(bào)道諸多報(bào)告基因譜系[5-15]。然而這其中多為單一報(bào)告基因譜系，即靶向定位于ROSA 26和LacZ或各種熒光蛋白。單一報(bào)告基因譜系最顯著的缺陷在于報(bào)告基因的表達(dá)僅發(fā)生在Cre酶切作用之后，因此當(dāng)報(bào)告基因表達(dá)減弱時(shí)，并沒有良好的內(nèi)參對(duì)照來區(qū)分其源于報(bào)告基因自身表達(dá)改變還是廣泛表達(dá)的啟動(dòng)子失活。在此基礎(chǔ)上，雙重報(bào)告基因譜系應(yīng)運(yùn)而生。該譜系在與Cre重組酶結(jié)合前即可穩(wěn)定表達(dá)某種報(bào)告基因，當(dāng)酶切作用發(fā)生后方可激活第二種報(bào)告基因[15]。這種雙重報(bào)告基因的優(yōu)勢(shì)在于，始終有某一報(bào)告基因可持續(xù)表達(dá)于單個(gè)細(xì)胞中，保證了內(nèi)參對(duì)照的存在。本實(shí)驗(yàn)所選擇的紅色熒光蛋白報(bào)告基因小鼠IRG[16]，與Cre重組酶結(jié)合前可在全身各組織廣泛表達(dá)紅色熒光蛋白。當(dāng)該小鼠和組織特異性hNPHS2-Cre重組酶結(jié)合后，在特定組織中Cre可產(chǎn)生酶切作用激活第二種報(bào)告基因，從而表達(dá)EGFP。而哺乳動(dòng)物中，hNPHS2僅在腎小球足細(xì)胞中具有特異性表達(dá)，常被用于該區(qū)域的分子標(biāo)記。因此，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建雙重?zé)晒獾鞍讟?biāo)記小鼠模型，可實(shí)現(xiàn)對(duì)hNPHS2表達(dá)細(xì)胞的熒光標(biāo)記，建立適用于小鼠足細(xì)胞的分選方法，為獲得更可靠的新鮮分離足細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜研究奠定基礎(chǔ)。

盡管如此，研究足細(xì)胞在疾病發(fā)病中的分子機(jī)制等領(lǐng)域仍受到諸多限制，現(xiàn)有的技術(shù)由于不能獲得滿足基因組學(xué)研究水平的產(chǎn)量和純度而未得到廣泛應(yīng)用。為改善新鮮分離足細(xì)胞產(chǎn)量低的不足，許多的研究試圖使用原代培養(yǎng)或永生化足細(xì)胞[17]。然而這種做法存在許多公認(rèn)的劣勢(shì)。主要原因如下(1)足細(xì)胞是高度特異性、終末分化的上皮細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境可快速改變其細(xì)胞生物學(xué)特性，終末分化、有絲分裂后的細(xì)胞去分化并開始再次分裂。不同的培養(yǎng)條件可導(dǎo)致不同的結(jié)果，更重要的是，諸如裂隙隔膜這類分化足細(xì)胞的重要標(biāo)志，在體外培養(yǎng)的環(huán)境下并不能形成；(2)在大多數(shù)疾病模型中，體外培養(yǎng)的足細(xì)胞不可能復(fù)制體內(nèi)疾病環(huán)境。

目前現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)技術(shù)尚不能獲得滿足基因組學(xué)水平要求的足細(xì)胞，成為目前阻礙足細(xì)胞研究的主要難題。腎小球三種固有細(xì)胞——系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞之間的緊密連接加大了從生物樣本中分離足細(xì)胞的難度。由于在人和小鼠體內(nèi)，腎小球體積占腎總質(zhì)量的比例小于5%，而足細(xì)胞又僅存在于腎小球，因此本實(shí)驗(yàn)采用的首先提取腎小球的方法可相對(duì)富集足細(xì)胞。目前，在人和大鼠中廣泛應(yīng)用的篩分技術(shù)可提取純化率高達(dá)90%腎小球[20]，針對(duì)小鼠則多使用磁性顆粒灌注后磁珠分離法[21,2]。盡管如此，腎小球中足細(xì)胞周圍鄰近存在的系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也限制了對(duì)于足細(xì)胞特有功能的研究。在此基礎(chǔ)上，Murakami等[22]和Akilesh等[23]應(yīng)用足細(xì)胞特異性抗體(如nephrin,podocalyxin)，從細(xì)胞懸液中分離足細(xì)胞及非足細(xì)胞。此種方法很大程度上受限于所使用抗體的特異性，因此存在產(chǎn)量低、效率低的劣勢(shì)。此外，如果分選細(xì)胞的特異性標(biāo)志物位于細(xì)胞內(nèi)，可能因?yàn)槿旧珮?biāo)記時(shí)所需的透化步驟導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞死亡。為加以改進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用僅在足細(xì)胞特異表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因老鼠，利用酶消化法進(jìn)一步分離腎小球，由FACS技術(shù)從獲得的單細(xì)胞懸液中分離足細(xì)胞。針對(duì)以往方法中存在的分離細(xì)胞產(chǎn)量低的不足， 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了如下改進(jìn)：(1)將原有實(shí)驗(yàn)方法中的心臟灌注改為腎動(dòng)脈直接灌注，這種方法避免磁珠進(jìn)入體循環(huán)產(chǎn)生無效灌注，同時(shí)節(jié)約了磁珠的使用量；(2)改進(jìn)消化液配方，加用蛋白酶E及脫氧核糖核酸酶1，提高消化效率，盡量減少分離腎小球在37℃消化時(shí)間，避免酶消化引起的細(xì)胞分子表型和基因表達(dá)的改變。在此基礎(chǔ)上，提純產(chǎn)量較之以往增加2～3倍，結(jié)果顯示平均每只小鼠可獲得大于3×105個(gè)足細(xì)胞，此產(chǎn)量可滿足轉(zhuǎn)錄譜及定量蛋白組學(xué)研究。

盡管本實(shí)驗(yàn)所用提純分離足細(xì)胞的方法在某些方面優(yōu)于以往報(bào)道的方法，但是仍不能忽視其中可能存在的問題。首先，由于熒光激發(fā)分選儀(BD,AriaII)在紅色熒光處激發(fā)波長并不能精確探測(cè)本實(shí)驗(yàn)所涉及的紅色熒光蛋白，因此在分選時(shí)紅色熒光高值區(qū)域比實(shí)際腎小球非足細(xì)胞比例低。其次，目前使用的所有提純足細(xì)胞方法均需在37℃下酶消化，分離腎小球及其周圍非腎小球結(jié)構(gòu)，從而將足細(xì)胞從非足細(xì)胞腎小球細(xì)胞中分離出來。眾所周知，機(jī)械損傷和酶消化均有可能在分離過長中改變足細(xì)胞的分子表型。與現(xiàn)有方法相比，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將細(xì)胞在37℃消化時(shí)間由1.5h縮短至55 min，實(shí)驗(yàn)全過程從處死小鼠至凍存分選后的細(xì)胞沉淀由原來4h減少至2.5h。針對(duì)流式細(xì)胞分選過程，所有待分選樣品均在4℃保存，盡可能縮短置于室溫至單細(xì)胞懸液上樣分選的時(shí)間。遺憾的是，目前尚無任何更優(yōu)化方法可省略酶消化步驟而將足細(xì)胞從其自然三維環(huán)境中分離出來[2，4，5]。另外，足細(xì)胞標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小鼠的培育需要花費(fèi)大量的時(shí)間及經(jīng)費(fèi)，尤其是在研究疾病模型時(shí)仍涉及遺傳變異等問題(糖尿病模型的db/db小鼠[24]，CD2AP基因敲除小鼠[25])。然而，與依靠抗體進(jìn)行低效率磁激活的細(xì)胞分選法相比，使用轉(zhuǎn)基因模型所獲得高產(chǎn)量、高純度足細(xì)胞仍不失為一種更有效的方法。

小結(jié)：應(yīng)用FACS技術(shù)可有效的從熒光標(biāo)記小鼠中提取高純度足細(xì)胞，其產(chǎn)量和純度為進(jìn)一步開展足細(xì)胞基因組學(xué)、蛋白組學(xué)水平研究奠定了基礎(chǔ)。

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