王　玉　孫　偉　左　科　王　霞　鄭春霞　高友鶴　劉志紅

尿液一直是尋找腎臟病無(wú)創(chuàng)性標(biāo)志物的良好來(lái)源。但是，在疾病狀態(tài)下，腎小球?yàn)V過(guò)屏障及相關(guān)腎單位結(jié)構(gòu)受損，大量血漿中的高豐度蛋白進(jìn)入尿液，其所形成的高豐度抑制使得尿液蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)這類患者的探索面臨不少困難。

多種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于這類疾病尿液蛋白的研究，例如二維電泳-質(zhì)譜(2DE-MS),表面增強(qiáng)激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-MS)，和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜(CE-MS)[1-3]。同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ)標(biāo)記的液質(zhì)聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法是一種新的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略，它具有定量較準(zhǔn)確，全面分析中低豐度蛋白等優(yōu)點(diǎn)。目前已廣泛應(yīng)用于血液、組織、正常尿蛋白質(zhì)組學(xué)[4-6]，但還未應(yīng)用于腎小球疾病患者尿液的報(bào)道。

膜性腎病(MN)和局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)是臨床上導(dǎo)致腎病綜合征最常見(jiàn)的兩種病理類型。目前對(duì)上述疾病的診斷依賴于腎活檢組織病理學(xué)檢查，尚缺乏用于診斷、鑒別診斷、判斷病情及指導(dǎo)治療的無(wú)創(chuàng)性標(biāo)志物。本研究中，我們建立了聯(lián)合白蛋白/IgG抗體清除和ITRAQ標(biāo)記的二維液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(2D-LC MS/MS)用的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)方法，并對(duì)臨床表現(xiàn)腎病綜合征的MN和FSGS患者的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行比較分析。

對(duì)象和方法

研究材料本研究得到南京軍區(qū)南京總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。尿液樣本來(lái)源于2012年南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腎臟科住院和門診患者，標(biāo)本采集經(jīng)患者本人或家屬知情同意。收集研究對(duì)象的隨機(jī)尿50 ml，立即放入4℃暫存。

研究對(duì)象入選標(biāo)準(zhǔn)：臨床表現(xiàn)腎病綜合征，病理證實(shí)MN或FSGS，目前腎病范圍蛋白尿未緩解(尿蛋白定量>3.5 g/d，血清白蛋白<30 g/L)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)所有患者排除代謝性疾病、自身免疫病、腫瘤、重金屬中毒等繼發(fā)性因素；(2)排除收集尿液時(shí)合并感染、血栓、血清肌酐升高(>176.8 μmol/L)、嚴(yán)重肝功能不全的患者；(3)排除月經(jīng)期女性。

研究對(duì)象隨機(jī)分組：MN分為三組， 每組5例患者(MN1， MN2 和MN3組)； FSGS分為三組，每組5例患者(FSGS1， FSGS2 和FSFS3 組)(表1)。

表1　膜性腎病(MN)和局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)患者的臨床資料及分組

試劑和儀器本實(shí)驗(yàn)所用二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、嗎啡啉乙磺酸(MES)、碳酸氫銨等購(gòu)自Sigma公司,乙腈、甲酸、三氟乙酸等購(gòu)自ABI公司，ProteoPrep免疫親和白蛋白/IgG清除試劑盒購(gòu)自Sigma公司，10 kd濾器購(gòu)自Millipore公司，胰酶購(gòu)自Protégé公司，C18 spin column除鹽柱購(gòu)自The Nest Group公司，iTRAQ試劑購(gòu)自ABI公司,真空離心濃縮儀SPD121P-230購(gòu)自Thermo公司，Magic C18AQ液相色譜柱購(gòu)自Michrom公司，LTQ-Obitrap質(zhì)譜儀購(gòu)自thermo公司。

樣品處理

丙酮沉淀尿液樣本于5 000g，4℃，離心30 min 去除細(xì)胞碎屑，加入3倍體積-20℃預(yù)冷丙酮，4℃放置4h時(shí)，14 000g，4℃，離心30 min,去除上清，保留蛋白沉淀。碳酸氫銨復(fù)溶蛋白沉淀，10 000g，4℃，離心10 min去除沉淀，保留上清，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

蛋白質(zhì)樣品組內(nèi)混合從MN1、MN2、MN3、FSGS1、FSGS2、FSGS3組內(nèi)的各5例樣品取等量蛋白進(jìn)行組內(nèi)混合。

去除高豐度蛋白按照ProteoPrep免疫親和白蛋白/IgG清除試劑盒操作說(shuō)明,去除以上各組高豐度蛋白,Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

蛋白質(zhì)酶切各組樣品中分別加入20 mmol/L DTT 37℃還原1h,再加入50 mmol/L IAA室溫避光反應(yīng)45 min,加入10 kD膜離心，8 mol/L尿素-Tris/HCl溶液清洗2次，碳酸氫銨清洗2次后復(fù)溶，按1∶20加入胰酶37℃消化過(guò)夜，多肽樣品除鹽后抽干備用。

iTRAQ標(biāo)記分別向各組抽干后肽段中加入等量iTRAQ試劑盒自帶試劑溶解肽段，分別取等量6組溶解后肽段進(jìn)行混合，作為內(nèi)參；取兩組iTRAQ試劑，向iTRAQ標(biāo)記試劑114、115、116、117中分別加入等量70%乙醇重懸標(biāo)記試劑；向一組iTRAQ試劑114、115、116、117重懸試劑中加入內(nèi)參、MN1、MN2、MN3；另一組iTRAQ試劑114、115、116、117重懸試劑中加入內(nèi)參、FSGS1、FSGS2、FSGS3，室溫孵育1h；取標(biāo)記后的內(nèi)參(114標(biāo)記)、MN1(115標(biāo)記)、MN2(116標(biāo)記)、MN3(117標(biāo)記)；內(nèi)參(114標(biāo)記)、FSGS1(115標(biāo)記)、FSGS2(116標(biāo)記)、FSGS3(117標(biāo)記)樣品按1∶1∶1∶1分兩組進(jìn)行混合，真空離心濃縮抽干樣品，保存于-20℃。實(shí)驗(yàn)前將樣品溶于適量1‰氨水(pH=10)中，濃度調(diào)整到5 μg/ul。

質(zhì)譜分析

高pH值反相液相色譜分離反相柱為250 mm×4.6 mm,洗脫液為5%～30%緩沖液A(0.1%氨水，99.9%乙腈，pH=10,流速1 ml/min),洗脫時(shí)間為60 min。每1 min收集1個(gè)組分，共收集60個(gè)組分。各組分抽干后，每間隔2個(gè)組分混合，共混合成20個(gè)組分，進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。

液質(zhì)聯(lián)用分析反相分離：反相柱為100 mm×0.075 mm,洗脫液為5%～30%緩沖液B(0.1%甲酸，99.9%乙腈，流速300 nl/min),洗脫時(shí)間為2h。TripleTOF5600質(zhì)譜檢測(cè)：質(zhì)核比檢測(cè)范圍為350～1 250 amu，應(yīng)用數(shù)據(jù)依賴方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，每次全掃描后做30次二級(jí)掃描，母離子質(zhì)核比寬度為0.7 amu，35%標(biāo)準(zhǔn)碰撞能量，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為15s。

生物信息學(xué)分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)用MASCOT(V2.3.02)進(jìn)行檢索，所用數(shù)據(jù)庫(kù)為swissProt人的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。參數(shù)：酶為Trypsin,誤切位點(diǎn)2，多肽和子離子質(zhì)量誤差范圍為0.05 D，半胱氨酸的脲甲基化修飾。所有質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果同時(shí)應(yīng)用反相數(shù)據(jù)庫(kù)檢索方法評(píng)估數(shù)據(jù)的假陽(yáng)性率(假陽(yáng)性率=反相數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定肽段數(shù)/正向數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定肽段數(shù)×100%)。檢索結(jié)果用Scafford軟件進(jìn)行分析。蛋白和多肽假陽(yáng)性率<1%，每個(gè)蛋白至少有2個(gè)多肽。

Gene Ontology(GO)分析應(yīng)用PANTHER軟件 (http://www.pantherdb.org/)根據(jù)分子功能、生物過(guò)程、細(xì)胞定位三種注釋進(jìn)行蛋白質(zhì)分類。

結(jié)　　果

蛋白尿蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜鑒定通過(guò)白蛋白/IgG抗體清除結(jié)合iTRAQ標(biāo)記2D-LC MS/MS分析(圖1)，在6組蛋白尿樣品中共鑒定到809個(gè)蛋白。根據(jù)譜圖數(shù)相對(duì)定量，估算鑒定蛋白中豐度排名前10位的蛋白，并與血蛋白質(zhì)組前10位高豐度蛋白進(jìn)行比較[7]。蛋白尿蛋白質(zhì)組前10位蛋白都來(lái)自于血液，但蛋白尿前10位蛋白與血蛋白質(zhì)前10位蛋白種類及排序差別較大。

圖1　實(shí)驗(yàn)流程圖

圖2　根據(jù)蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行分析的結(jié)果

圖3　根據(jù)蛋白質(zhì)所屬的細(xì)胞成分進(jìn)行分析的結(jié)果

圖4　根據(jù)蛋白質(zhì)的分子功能進(jìn)行分析的結(jié)果

GO功能分析應(yīng)用PANTHER軟件對(duì)所有鑒定蛋白質(zhì)進(jìn)行注釋分類，顯示根據(jù)分子功能,前三位分類蛋白質(zhì)屬于催化活性、結(jié)合、受體活性(圖2)。根據(jù)生物過(guò)程，前三位分類蛋白屬于代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、發(fā)育過(guò)程(圖3)。根據(jù)細(xì)胞定位，前三位分類蛋白質(zhì)屬于細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞成分、細(xì)胞外基質(zhì)(圖4)。

差異蛋白篩選本實(shí)驗(yàn)采用兩組4標(biāo) iTRAQ試劑，每組iTRAQ試劑有114、115、116、117四種同位素。一組iTRAQ試劑114、115、116、117分別標(biāo)注內(nèi)參、MN1、MN2、MN3，另一組iTRAQ試劑114、115、116、117分別標(biāo)注內(nèi)參、FSGS1、FSGS2、FSGS3。共進(jìn)行了3次重復(fù)LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定，以報(bào)告離子為m/z 114作內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量，分別計(jì)算每個(gè)蛋白在MN和FSGS三次質(zhì)譜鑒定中的115∶114,116∶114,117∶114比值,即可獲得MN1、MN2、MN3、FSGS1、FSGS2、FSGS3共6個(gè)相對(duì)定量值，根據(jù)115標(biāo)注MN1/FSGS1,116標(biāo)注MN2/FSGS2,117標(biāo)注MN3/FSGS3比值即可得到三組每個(gè)蛋白在MN和FSGS豐度的相對(duì)變化值fold chang,根據(jù)115、116、117三個(gè)值可計(jì)算每個(gè)蛋白在MN或FSGS三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)CV1、CV2，根據(jù)3個(gè)fold change計(jì)算變異系數(shù)CV3。符合以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)入差異蛋白分析：(1)鑒定蛋白特異性多肽≥2；(2) 任一fold chang≥1.5；(3)CV1、CV2、CV3值均<0.6。符合條件差異蛋白16個(gè)，具體與疾病的關(guān)系仍待進(jìn)一步的研究加以確認(rèn)。

討　　論

蛋白尿不僅是腎臟病最具診斷意義的變化，其程度也是臨床上用于判斷病情、評(píng)估治療效果和預(yù)測(cè)預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。目前，臨床上只能對(duì)其進(jìn)行定量分析，缺乏質(zhì)的分析，更缺乏疾病特異性的相關(guān)蛋白質(zhì)標(biāo)志物。利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，從中患者尿液中尋找腎臟疾病標(biāo)志物將有助于我們提高對(duì)這類患者診斷和治療的水平。

我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，大量蛋白尿蛋白質(zhì)組有著接近于血漿蛋白質(zhì)組的高豐度抑制。怎樣減少蛋白質(zhì)組研究中的高豐度抑制效應(yīng)，使蛋白質(zhì)組中、低豐度蛋白成分的檢測(cè)不至于因此而受到干擾是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一個(gè)極具挑戰(zhàn)的問(wèn)題。盡管，采用蛋白質(zhì)分離聯(lián)合或不聯(lián)合高豐度蛋白清除技術(shù)已廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，但是，將其用于腎臟病患者尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究還很少。

六肽庫(kù)是基于20 種天然氨基酸合成的六肽配體組合文庫(kù),理論上可與近乎無(wú)限種類的氨基酸殘基結(jié)合,能結(jié)合每種多肽的配體是有限的，一旦六肽飽和,過(guò)量的蛋白就會(huì)被沖洗掉,六肽庫(kù)在有效降低高豐度蛋白的同時(shí),相對(duì)富集了低豐度蛋白。該技術(shù)在人類正常尿液、血液、組織樣本中得到了應(yīng)用[8-10]，提高了蛋白的鑒定數(shù)目?？贵w親和法是利用幾種單克隆或多克隆抗體特異性清除樣本中的高豐度蛋白，已有同時(shí)清除2種、6種、14種血液高豐度蛋白的抗體組合試劑盒，這些試劑盒被廣泛應(yīng)用于尋找血、尿蛋白質(zhì)組標(biāo)志物[11-13]。日本學(xué)者提出差異溶解術(shù)，利用有機(jī)溶劑溶取小分子量蛋白的特性，能較好的獲取分析血漿中的低豐度蛋白，但該技術(shù)并不是基于全蛋白質(zhì)組，目前該技術(shù)應(yīng)用尚少[14]。Chen等[12]將能清除14種高豐度蛋白的抗體柱與六肽庫(kù)分別應(yīng)用于正常尿蛋白質(zhì)組，通過(guò)iTRAQ技術(shù)比較二者的重復(fù)性發(fā)現(xiàn)，抗體柱的重復(fù)性較六肽庫(kù)好。 我們的前期實(shí)驗(yàn)比較了白蛋白/IgG抗體清除、六肽庫(kù)、差異溶解術(shù)三種高豐度清除策略應(yīng)用于腎病水平蛋白尿蛋白質(zhì)組的效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)六肽庫(kù)處理后樣品蛋白鑒定數(shù)略多于白蛋白/IgG抗體清除、差異溶解，但白蛋白/IgG抗體清除鑒定重復(fù)性明顯好于六肽庫(kù)和差異溶解(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，可能更適合比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。目前蛋白質(zhì)組學(xué)常用的蛋白質(zhì)分離技術(shù)有二維電泳(2DE)和高效液相色譜(HPLC)。2DE由于其耗時(shí)費(fèi)力、解析度及重復(fù)性較差等缺陷，目前應(yīng)用已越來(lái)越少。而HPLC因其適用性廣等優(yōu)點(diǎn)，目前在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的越來(lái)越多。目前基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)定量方法有非標(biāo)記定量和穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量，非標(biāo)記定量法所需樣品量少、操作簡(jiǎn)單，但是一次只能分析一個(gè)樣品，且在高豐度蛋白存在時(shí)，定量可能不準(zhǔn)確；相比之下，同位素標(biāo)記方法可分析多個(gè)樣品，定量更準(zhǔn)確[15]。目前應(yīng)用較普遍的同位素標(biāo)記方法是iTRAQ技術(shù)[16]。

本研究應(yīng)用白蛋白/IgG抗體清除聯(lián)合iTRAQ標(biāo)記的2D-LC MS/MS對(duì)臨床表現(xiàn)腎病綜合征的MN和FSGS患者的尿液進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)，從患者的蛋白尿中，我們共鑒定出809個(gè)蛋白，這是目前針對(duì)蛋白尿的最大規(guī)模的蛋白質(zhì)圖譜研究。GO分析顯示根據(jù)分子功能,鑒定蛋白主要屬于催化活性、結(jié)合、受體活性三個(gè)類別。根據(jù)生物學(xué)活性，鑒定蛋白主要參與代謝、細(xì)胞活動(dòng)和發(fā)展調(diào)控三個(gè)類別。根據(jù)細(xì)胞定位，鑒定蛋白主要屬于細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞成分、細(xì)胞外基質(zhì)三個(gè)類別。通過(guò)MN和FSGS患者尿液蛋白質(zhì)譜圖數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量，我們發(fā)現(xiàn)蛋白尿中前10位蛋白與血漿前10位蛋白差別很大，提示即使在病理情況下，腎臟可能對(duì)不同種類的蛋白仍保持不同的處理功能，蛋白尿可能有著不同于血蛋白質(zhì)組的組成架構(gòu)。目前仍無(wú)針對(duì)蛋白尿高豐度蛋白進(jìn)行抗體清除的檢測(cè)試劑盒，對(duì)蛋白尿整體構(gòu)架了解較少可能是制約其發(fā)展的重要原因。我們對(duì)蛋白尿的較全面的圖譜分析及根據(jù)譜圖數(shù)相對(duì)定量獲得的蛋白相對(duì)豐度構(gòu)成可能為今后腎臟病尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。通過(guò)iTRAQ標(biāo)記定量，我們篩選了16個(gè)差異蛋白，他們的生物學(xué)功能分別包括參與纖溶、免疫反應(yīng)、代謝過(guò)程、細(xì)胞增生等。

小結(jié)：本研究聯(lián)用高豐度蛋白抗體清除及iTRAQ標(biāo)記的2D-LC MS/MS對(duì)大量蛋白尿蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，得到較全面尿液蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜及一系列在MN和FSGS差異表達(dá)的蛋白質(zhì),表明該技術(shù)在大量蛋白尿尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究上可能有較好的應(yīng)用前景。研究中獲得的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜為開(kāi)展伴大量蛋白尿腎臟病患者尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了基礎(chǔ)；從MN和FSGS患者尿液中獲得的差異蛋白有待進(jìn)一步驗(yàn)證其與疾病診斷、治療及預(yù)后的關(guān)系。

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