張　濤　梁少姍　諶達程　鄭春霞　曾彩虹　章海濤　陳慧梅　劉志紅

血栓性微血管病(TMA)是一類病理損傷，臨床上特征性表現(xiàn)為多器官微血管血栓形成，并引起血小板減少、微血管病性溶血和臟器功能障礙；其主要發(fā)病機制是血管內皮細胞的損傷[1]。TMA通常表現(xiàn)為溶血性尿毒綜合征(HUS)和血栓性血小板減少性紫癜(TTP)[2]，導致TMA的疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗磷脂抗體綜合征、惡性高血壓、先兆子癇、感染、藥物相關內皮損傷及器官移植術后血管性排斥等[3-5]。

TMA以溶血性貧血、血小板減少和臟器缺血性失功為臨床表現(xiàn)，腎臟是主要的受累器官之一[6,7]。越來越多的證據表明，腎臟存在TMA預示著腎臟的存活率和預后較差，及時的診斷和治療尤其關鍵[7，8]。目前，腎活檢是TMA病理診斷的金標準，但臨床上，TMA患者經常存在凝血功能異常、血紅蛋白(Hb)下降、血小板低下和病情危重等禁忌證，難以及時行腎活檢并指導治療[9,10]。一些臨床表現(xiàn)和特異的實驗室指標提示TMA病變，包括Hb、血小板的下降，內皮功能的異常，以及乳酸脫氫酶(LDH)的明顯上升等，但目前尚無統(tǒng)一的標準[11,12]。因此，本研究比較分析了TMA患者的實驗室指標，以期提供TMA早期診治和預測預后的非創(chuàng)傷性方法。

對象和方法

研究對象選取2011年7月至2012年7月于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腎臟科疑診的TMA患者。入選標準：(1)腎功能損害(蛋白尿、血尿或腎功能不全，血清肌酐(SCr)>109.6 μmol/L);(2)微血管病性溶血性貧血(Hb<12 g/dl[11 g/dl,女])，外周血紅細胞碎片陽性(>5個)，LDH升高(LDH>240 U/L)；(3)病程中有血小板下降(最低值<100×109/L)；(4)臨床及腎臟病理資料完整，初次資料在免疫抑制治療或血漿置換前獲得。均隨訪至2013年10月，臨床資料不完整或隨訪少于12月患者予排除[13,14]。

入選建模組的疑診TMA患者共220例，其中腎活檢明確診斷TMA 51例。驗證組包括46例另外疑診TMA患者和157例疑診TMA的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者，兩組分別確診TMA病變20例和27例，研究的設計流程見圖1。

圖1　研究流程圖

臨床資料和實驗室結果收集患者年齡、性別、起病至確診時病程，并發(fā)癥及實驗室檢查：活檢時24h尿蛋白定量、鏡下血尿、Hb、血小板、SCr、血清球蛋白、補體C3/C4、LDH、血管性血友病因子裂解蛋白酶13(ADAMTS13)酶活性及抗體。內皮指標包括血栓調節(jié)蛋白(THBD)、E選擇素、可溶性血管細胞黏附分子1 (sVCAM-1)和正常內皮細胞(NEC)。

血清ADAMTS13活性是由熒光共振能量轉移法(Fluorescence Resonance Energy TrANSFER,FRET)測定，此方法通過ADAMTS13蛋白酶水解重組的血管性血友病因子86(vWF86)-ALEXA FRET底物，從而解離ALEXA熒光物質，使可檢測到的熒光增加，以此量化ADAMTS13的活性[15]。血清抗ADAMTS13 IgG抗體(SekisuiDiagnostics，美國)、vWF的(Sunbiote，中國)、THBD(Diaclone，法國)、E選擇素(R&D，美國)和sVCAM-1( R&D，美國)都采用酶聯(lián)免疫吸附法測定。NEC在循環(huán)中的濃度，使用磁珠分選法(MACS，德國)測定[16]。

病理資料與相關定義所有病例均在B 超引導下行腎活檢術。腎穿刺活檢組織經甲醛固定,石蠟包埋,切片厚度為2 μm,腎組織進行光鏡、電鏡及免疫熒光檢查。光鏡染色包括HE,PAS,PASM-Masson及Masson三色染色。腎活檢標本要求腎小球數≥10個，間質小血管和入球動脈> 10個。TMA定義為至少一個腎小球或者小動脈可見閉塞性纖維蛋白-血小板血栓，同時具有以下病變之一：(1)光鏡腎小球“雙軌樣”改變,電鏡腎小球內皮下間隙疏松、增寬；(2)腎小球袢腔內纖維素樣血栓和(或)變形的紅細胞；(3)動脈管腔內纖維素樣血栓和(或)變形的紅細胞；(4)動脈黏液樣變性、動脈蔥皮樣改變或動脈內膜纖維性增生；(5)腎皮質壞死[7,17]。

SLE診斷標準為1997年美國風濕病學會修訂版SLE診斷標準[18]。隨訪腎臟終點事件包括SCr倍增、死亡或進入終末期腎病(ESRD)，ESRD定義為估算的腎小球濾過率(eGFR)<15 ml/(min·1.73m2)或進入維持性腎臟替代治療。腎功能穩(wěn)定定義為SCr維持正常范圍或上升少于初發(fā)的50%。腎存活率定義為隨訪中未進入ESRD或未達死亡患者的比例，人生存率定義為隨訪存活患者所占比例。

統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0軟件錄入和整理資料并進行統(tǒng)計學分析。兩組間資料比較采用Mann-Whitney檢驗或卡方檢驗。Logistic回歸用于與TMA相關實驗室指標的綜合分析，并采用受試者工作特征(ROC)曲線獲取分界值，以最佳擬合模型的曲線下面積(AUC)計算，進行靈敏度和特異的評價。并運用Bootstrap方法和Hosmer-Lemeshow檢驗交叉驗證所建模型的擬合度。累計腎臟生存率采用Kaplan-Meier生存概率計算。所有統(tǒng)計學檢驗均為雙側檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為統(tǒng)計學差異顯著。

結　　果

一般情況據腎活檢病理結果，入建模組的220例疑診患者中，分為TMA組(n=51)和非TMA組(n=169)，兩組患者年齡、性別無明顯差異。TMA組中特發(fā)的HUS/TTP患者15例(29.4%)，繼發(fā)的 TMA患者36例(70.6%)，繼發(fā)疾病主要為自身免疫性疾病29例(56.9%)，余為妊娠5例(9.8%)，惡性高血壓1例(1.96%)，器官移植1例(1.96%)(表1)。

表1　TMA患者和非TMA患者腎活檢時的臨床資料及實驗室指標

續(xù)表1

實驗室指標中兩組間在血小板、Hb、LDH、SCr、ADAMTS13活性和THBD 有明顯差異(均P≤0.001)，TMA組患者較非TMA組發(fā)病時SCr、LDH和THBD水平明顯增高，而Hb、血小板、ADAMTS13活性水平都明顯減低，而24h尿蛋白、尿沉渣、補體、球蛋白、NEC、E選擇素、VCAM及ADAMTS13抗體、vWF水平無顯著差異。兩組隨訪12月TMA組患者預后更差，腎存活率僅為54.9 %，非TMA組腎存活率為74.6%,兩組間有差異(P=0.015)，1年累計腎臟Kaplan-Meier生存率兩組間差異顯著(P=0.002,圖2)。隨訪觀察兩組間人存活率無明顯差異(P=0.115)(表1)。

圖2　TMA組患者和非TMA組腎生存率的比較

Logistic回歸模型的建立基于建模組患者的實驗室資料， 6個實驗室指標(血小板、Hb、LDH、SCr、ADAMTS13活性和THBD)在TMA組和非TMA組間有顯著差異(均P<0.05)，以P值0.05作為納入界值，這6個指標被進一步納入多因素Logistic回歸分析，用逐步法建立模型，綜合分析結果表明SCr，血小板，LDH和ADAMTS13活性為腎臟TMA病變的有效預測指標(均P<0.05，表2)，建立Logistic 回歸方程：

Logit P=-0.371-0.002×ADAMTS13活性+0.140×SCr+0.004×LDH-0.010×PLT

以上方程診斷TMA病變的預測概率擬合ROC曲線，AUC為0.800(95%CI 0.723～0.877，P<0.001，圖3)。當分界值取0.248時，大于界值即為TMA,這個診斷模型的敏感度為81.6%，特異度為66.9%。

圖3　診斷模型預測220例建模組中TMA的ROC曲線

表2　TMA相關實驗室指標的Logistic回歸分析結果(n=220)

診斷模型的驗證應用Bootstrap方法對診斷模型進行驗證，這結合四個實驗室指標診斷模型的交叉驗證AUC為0.803，校準曲線的截距和斜率分別為0.07和0.64。運用Hosmer-Lemeshow檢驗診斷模型，其擬合度良好(P=0.489)，交叉驗證兩曲線間關聯(lián)緊密。

在獨立的46例疑診患者中進行這一診斷模型的進一步驗證。這46例患者的相關臨床資料見表3，其中腎活檢診斷為TMA的患者20例(43.5%)，非TMA患者26例(56.5%)。TMA診斷模型在46例患者中預測TMA病變的AUC為0.815 (95%CI 0.685～0.946，P<0.001，圖4)。取分界值0.248，這組患者中診斷模型的敏感度為75%，特異度為84.6%。

表3　獨立的驗證組患者的實驗室指標(n=46)

圖4　診斷模型在獨立的驗證組中驗證的ROC曲線

在157例疑診有TMA病變的SLE患者中再次進行了這一診斷模型的驗證，這組患者中腎活檢診斷為TMA的患者27例(17.2%)，非TMA患者130例(82.8)，兩組患者間年齡、性別無差異，在這組患者中診斷模型預測TMA病變的AUC達0.852(P<0.001，圖5)。取分界值為0.248時，這個診斷模型的敏感度為83.3%，特異度為73.0%。

圖5　診斷模型在SLE患者組中驗證的ROC曲線

表4　系統(tǒng)性紅斑狼瘡驗證組患者的臨床資料及實驗室指標(n=157)

討　　論

TMA這一病理損傷的發(fā)病機制目前仍未清楚，可能是多種機制聯(lián)合作用，包括血管內皮細胞損傷、凝血纖溶障礙、自身免疫及遺傳等。病因更是多種多樣，如感染、藥物、化學物質等，故TMA發(fā)病率低，但并不罕見，特別是繼發(fā)性TMA，目前報道繼發(fā)TMA又以SLE為首[3,7,19,20]。TMA臨床表現(xiàn)復雜，癥狀缺乏規(guī)律性，目前診斷標準尚難以統(tǒng)一[21,22]，確診需要腎活檢證實存在微血管血栓，因此，無創(chuàng)的診斷方法有廣闊的運用前景。本研究基于TMA相關的實驗室指標變化，建立了新診斷模型，并進行了系統(tǒng)驗證，這一診斷模型無創(chuàng)，可準確地預測組織學上的TMA病變。而據目前資料，這是首次提出預測TMA病變的無創(chuàng)診斷模型。

既往研究表明，TMA病理變化和患者腎臟預后顯著相關，TMA患者其腎臟預后差[23,24]。本研究中腎活檢確診TMA的患者腎臟預后不良，腎臟終點事件發(fā)生率高于非TMA者，1年腎累計生存率明顯低于非TMA患者，這也和相關報道[25]。根據腎活檢病理是否為TMA分組，建立的Logistic回歸模型中包含4個實驗室指標(SCr，LDH，血小板和ADAMTS13活性)，這些實驗室指標易于檢測，便于動態(tài)觀察。

這一診斷模型中4個實驗室指標與臨床癥狀和(或)TMA組織學病變明顯相關。TMA病變的臨床主要特征之一即為血栓形成，血小板減少，約90%的患者可出現(xiàn)血小板減少，嚴重者血小板下降明顯，可達1萬/ml以下，血小板減少程度和持續(xù)時間與腎功能衰竭可不一致[26]。相關報道顯示TMA病變患者中腎臟受累達40%～80%，表現(xiàn)為尿檢和腎功能異常[7]，本研究患者皆有腎臟受累，可能與患者皆為腎內科首次診斷有關。同時LDH的水平變化通常也反映組織缺血及溶血程度，是臨床經常監(jiān)測病情變化的指標之一，但LDH異常在其他臟器損傷中也常常觀察到[27,28]。ADAMTS13在TMA研究進展中備受關注，近期研究表明ADAMTS13 的嚴重缺乏與遺傳性TTP明確相關，ADAMTS13活性常低于正常人的5%，但ADAMTS13活性減低也報道見于妊娠、肝病、自身免疫性疾病及慢性炎癥患者[29,30]。所以，這些實驗室指標異常是常見和非特異性的，單個指標運用于TMA的診斷是很困難的，本研究采用Logistic回歸綜合分析相關實驗室指標，由于Logistic回歸中計算結果與自變量的分布類型無關，這使其分析較常規(guī)分析更穩(wěn)健，可很好地處理協(xié)變量問題，并動態(tài)連續(xù)觀察回歸指標，從多變量中篩選出相關性好的診斷指標，構建可靠的回歸方程，有助于臨床診斷[31]。

本研究中構建的Logistic回歸方程，AUC達0.800，預測概率取界值0.248，這一模型診斷TMA病變具有極好的靈敏度(81.6%)和良好的特異度(66.9%)，交叉檢驗也說明這一診斷模型擬合度良好。進一步在46例獨立的疑診TMA患者中的驗證AUC為0.815，相同界值下敏感度為75%，特異度為84.6%。而在SLE患者中的驗證有更大的AUC和更高的靈敏度和特異度，在SLE患者中有更高的檢驗效率和診斷準確性。這對SLE患者腎臟病理進行分類、預后判斷和選擇治療都有益處，而且這還是非創(chuàng)傷性的診斷方法，在臨床應用極具潛力。

總之，TMA患者腎臟預后不良，需要及時診治，本研究提出了包含4個實驗室指標的診斷模型，為臨床提供了無創(chuàng)的TMA診斷方法，相關驗證也說明了該模型具有較高的診斷價值。當然，本研究也有其局限性。首先，這是回顧性研究，需要前瞻性隊列研究進行驗證；其次，入組患者疾病譜較窄，繼發(fā)因素以自身免疫疾病患者為主，其他病因例數較少；驗證中也使用了非獨立的數據，無法更深入地評估這一診斷模型的實用性。

1Moake JL.Thrombotic microangiopathies.N Engl J Med,2002,347(8):589-600.

2Laurence J.Pathological and therapeutic distinctions in HUS/TTP.Lancet,2000,355(9202):497.

3Hughson MD,Nadasdy T,McCarty GA,et al.Renal thrombotic microangiopathy in patients with systemic lupus erythematosus and the antiphospholipid syndrome.Am J Kidney Dis,1992,20(2):150-158.

4Noris M,Remuzzi G.Thrombotic microangiopathy after kidney transplantation.Am J Transplant,2010,10(7):1517-1523.

5van den Born BJ,van der Hoeven NV,Groot E,et al.Association between thrombotic microangiopathy and reduced ADAMTS13 activity in malignant hypertension.Hypertension,2008,51(4):862-866.

6Symmers WS.Thrombotic microangiopathic haemolytic anaemia (thrombotic microangiopathy).Br Med J,1952,2(4790):897-903.

7Barbour T,Johnson S,Cohney S,et al.Thrombotic microangiopathy and associated renal disorders.Nephrol Dial Transplant,2012,27(7):2673-2685.

8George JN,Vesely SK,Terrell DR.The Oklahoma Thrombotic Thrombocytopenic Purpura-Hemolytic Uremic Syndrome (TTP-HUS) Registry:a community perspective of patients with clinically diagnosed TTP-HUS.Semin Hematol,2004,41(1):60-67.

9Clark WF.Thrombotic microangiopathy:current knowledge and outcomes with plasma exchange.SeminDial,2012,25(2):214-219.

10 Stiles KP,Yuan CM,Chung EM,et al.Renal biopsy in high-risk patients with medical diseases of the kidney.Am J Kidney Dis,2000,36(2):419-433.

11 Furlan M,Robles R,Galbusera M,et al.von Willebrand factor-cleaving protease in thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic-uremic syndrome.N Engl J Med,1998,339(22):1578-1584.

12 Park YA,Waldrum MR,Marques MB.Platelet count and prothrombin time help distinguish thrombotic thrombocytopenic purpura-hemolytic uremic syndrome from disseminated intravascular coagulation in adults.Am J Clin Pathol,2010,133(3):460-465.

13 Ferrari S,Scheiflinger F,Rieger M,et al.Prognostic value of anti-ADAMTS 13 antibody features (Ig isotype,titer,and inhibitory effect) in a cohort of 35 adult French patients undergoing a first episode of thrombotic microangiopathy with undetectable ADAMTS 13 activity.Blood,2007,109(7):2815-2822.

14 Cataland SR,Yang S,Wu HM.The use of ADAMTS13 activity,platelet count,and serum creatinine to differentiate acquired thrombotic thrombocytopenic purpura from other thrombotic microangiopathies.Br J Haematol,2012,157(4):501-503.

15 Peng J,Gong L,Si K,et al.Fluorescence resonance energy transfer assay for high-throughput screening of ADAMTS1 inhibitors.Molecules,2011,16(12):10709-10721.

16 White LE,Cui Y,Shelak CM,et al.Lung endothelial cell apoptosis during ischemic acute kidney injury.Shock,2012,38(3):320-327.

17 El Karoui K,Hill GS,Karras A,et al.A clinicopathologic study of thrombotic microangiopathy in IgA nephropathy.J Am Soc Nephrol,2012,23(1):137-148.

18 Hochberg MC.Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus.Arthritis Rheum,1997,40(9):1725.

19 Zhang W,Shi H,Ren H,t al.Clinicopathological characteristics and outcome of Chinese patients with thrombotic thrombocytopenic purpura-hemolytic uremic syndrome:a 9-year retrospective study.Nephron Clin Pract,2009,112(3):c177-c183.

20 Tsai HM.Autoimmune thrombotic microangiopathy:advances in pathogenesis,diagnosis,and management.Semin Thromb Hemost,2012,38(5):469-482.

21 Mayer SA,Aledort LM.Thrombotic microangiopathy:differential diagnosis,pathophysiology and therapeutic strategies.Mt Sinai J Med,2005,72(3):166-175.

22 Schneider M.Thrombotic microangiopathy (TTP and HUS):advances in differentiation and diagnosis.Clin Lab Sci,2007,20(4):216-220.

23 Clark WF,Hildebrand A.Attending rounds:microangiopathic hemolytic anemia with renal insufficiency.Clin J Am Soc Nephrol,2012,7(2):342-347.

24 Michael M,Elliott EJ,Craig JC,et al.Interventions for hemolytic uremic syndrome and thrombotic thrombocytopenic purpura:a systematic review of randomized controlled trials.Am J Kidney Dis,2009,53(2):259-272.

25 Garg AX,Suri RS,Barrowman N,et al.Long-term renal prognosis of diarrhea-associated hemolytic uremic syndrome:a systematic review,meta-analysis,and meta-regression.JAMA,2003,290(10):1379-1381.

26 Ruggenenti P,Remuzzi G.The pathophysiology and management of thrombotic thrombocytopenic purpura.Eur J Haematol,1996,56(4):191-207.

27 Egan JA,Hay SN,Brecher ME.Frequency and significance of schistocytes in TTP/HUS patients at the discontinuation of plasma exchange therapy.J Clin Apher,2004,19(4):165-167.

28 Cohen JA,Brecher ME,Bandarenko N.Cellular source of serum lactate dehydrogenase elevation in patients with thrombotic thrombocytopenic purpura.J Clin Apher,1998,13(1):16-19.

29 Gandhi C,Motto DG,Jensen M,et al.ADAMTS13 deficiency exacerbates VWF-dependent acute myocardial ischemia/reperfusion injury in mice.Blood,2012,120(26):5224-5230.

30 Furlan M,Robles R,Solenthaler M,et al.Deficient activity of von Willebrand factor-cleaving protease in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura.Blood,1997,89(9):3097-3103.

31 Kim Y,Choi YK,Emery S.Logistic Regression with Multiple Random Effects:A Simulation Study of Estimation Methods and Statistical Packages.Am Stat,2013,67(3)：171-182.