蔣　松　施勁松　沈霞紅　盧穎輝　鄭春霞　鞠文君　劉志紅

糖尿病腎病(DN)是西方發(fā)達國家導(dǎo)致慢性腎功能不全的最主要的病因。在我國，隨著糖尿病發(fā)病率的不斷增加，DN也已成為慢性腎臟疾病的主要病因之一。DN的主要病理形態(tài)學改變?yōu)槟I小球體積增大、系膜區(qū)增寬、基質(zhì)增多及K-W結(jié)節(jié)等，伴隨著這些腎小球的病理改變，其基因表達的變化可能更加直接地反映了DN發(fā)生發(fā)展的分子機制。利用高通量轉(zhuǎn)錄組學方法獲取和分析DN患者腎小球全基因組表達數(shù)據(jù)，可以更加全面地了解DN的分子發(fā)病機制。

迄今為止，僅有關(guān)于高加索和美國黑人DN患者腎小球全基因組表達譜數(shù)據(jù)的研究，尚無大樣本中國漢族人群DN患者腎小球全基因組表達譜的觀察研究，更缺少比較漢族同其他種族DN患者腎小球基因表達差異的研究。本文首次檢測和分析了中國漢族DN患者腎小球的基因表達數(shù)據(jù)，并與高加索DN患者的數(shù)據(jù)進行比較，旨在為進一步探索DN發(fā)生發(fā)展的分子機制提供依據(jù)。

對象和方法

研究對象中國漢族DN患者：前瞻性入組2012年1～10月在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腎臟科住院，并行腎活檢明確診斷為DN的患者29例。入選標準：(1)符合1997年世界衛(wèi)生組織(WHO)2型糖尿病診斷標準；(2)病理形態(tài)學改變?yōu)楣忡R下腎小球體積增大，系膜區(qū)增生樣改變，或腎小球節(jié)段硬化，少細胞結(jié)節(jié)(K-W結(jié)節(jié))形成等；免疫熒光染色為寡免疫復(fù)合物沉積；(3)排除其他繼發(fā)性腎臟疾??；(4)有完整的臨床、病理及實驗室檢查記錄。

中國漢族正常對照組：前瞻性入組2012年1～10月在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科住院，診斷明確為腎癌的患者5例。入選標準：(1)尿常規(guī)、尿沉渣及24h尿蛋白定量陰性；(2)年齡<60歲；(3)血常規(guī)和血生化無明顯異常；(4)臨床無明顯消瘦等惡液質(zhì)表現(xiàn)；(5)患者的空腹血糖、餐后血糖和糖化血紅蛋白水平正常。

高加索人群DN患者的入組條件與中國漢族人群DN患者入組條件一致，對照組取自活體腎臟移植手術(shù)中活體供腎的新鮮活檢組織或腎臟腫瘤患者的癌旁腎臟組織。所有標本由美國密西根大學提供，來源于歐洲和美國高加索人群。分別有21例DN患者和35例對照組入選本研究。

新鮮腎組織收集DN患者腎組織收集：DN患者在簽署知情同意書后，于B超定位引導(dǎo)下，行負壓吸引法經(jīng)皮腎穿刺活檢術(shù)。在保證正常病理形態(tài)學檢查及不增加患者活檢風險的情況下，單獨收集長約1～1.5 cm的腎臟皮髓交界處的新鮮組織，立即置入10 ml RNA-later保存液中于-20℃保存。

正常對照組標本收集：在腎癌患者簽署知情同意書后，行患側(cè)腎臟切除。腎臟離體后立即在遠離腎臟腫瘤端切取4～5 cm3的皮髓交界處的組織塊作為對照組標本，立即置入20 ml RNA-later保存液中-20℃保存。

腎小球微分離將新鮮腎組織置于玻璃平皿中，加入2 ml RNA-later，置于體式顯微鏡下，將目鏡調(diào)整至8倍數(shù)，觀察腎組織內(nèi)的腎小球，利用腎小球微分離針進行腎小球微分離，剔除腎小球周圍的間質(zhì)組織和包囊壁，利用移液槍將微分離后的腎小球移至置有5 μl RNA-later的1.5 ml EP管中，每個EP管中置入15個微分離的腎小球，放入-80℃冰箱中保存，用于RNA提取。

RNA提取采用RNeasy micro kit(Cat#74004,QIAGEN,GmBH,Germany)并且根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標準操作流程進行樣品的總RNA 抽提，抽提所得總RNA經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)電泳質(zhì)檢合格后備用。要求RNA樣品RNA完整性指數(shù)≥7.0且28S/18S≥0.7。

RNA的放大和標記RNA采用Nugen表達譜實驗試劑盒，Ovation RNA amplification system kit(Cat#3100,Nugen),WB reagent(1300，Nugen)，Encore biotin module(4200，Nugen)對樣品總RNA中的mRNA進行放大、標記和純化，獲得帶有生物素(biotin)標記的cDNA。

芯片雜交本研究使用Affymetrix公司的Human U133 Plus 2.0芯片進行芯片雜交，該芯片可檢測已知 47 000 個基因的轉(zhuǎn)錄本。按照芯片配套提供的雜交標準流程和配套試劑盒，GeneChip? Hybridization，Wash and Stain Kit (Cat#900720， Affymetrix， Santa Clara，CA，US)，在滾動雜交爐，Hybridization Oven 645 (Cat#00-0331-220V,Affymetrix，Santa Clara，CA，US)中45℃，18h滾動雜交，雜交完成后在洗滌工作站Fluidics Station 450 (Cat#00-0079,Affymetrix,Santa Clara,CA,US)進行芯片的洗滌。

芯片掃描芯片結(jié)果采用GeneChip? Scanner 3000 (Cat#00-00212,Affymetrix，Santa Clara，CA，US)進行掃描，用Command Console Software 3.1 (Affymetrix,Santa Clara，CA，US)讀 取 原 始 數(shù) 據(jù)。進行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，質(zhì)控標準為：(1)背景值 Avg Background<100；(2)管家基因 Housekeeping Controls 3’端信號與 5’端信號比值至少有一個≤3。質(zhì)控合格數(shù)據(jù)進行下一步的生物信息學分析。

生物信息學分析

數(shù)據(jù)整合由于高加索人群的DN組和對照組的全基因組表達數(shù)據(jù)均來源于歐洲和美國高加索人群，且由實驗室分別進行標本采集，并分為兩組進行Affymetrix公司Human U133 plus 2.0芯片進行數(shù)據(jù)檢測，為消除芯片表達信號的差異，我們利用批次校正(Batch Correction)對不同來源的全基因表達譜數(shù)據(jù)進行整合，隨后利用主成分分析(PCA)評價整合后的高加索人群DN組和對照組的全基因組表達數(shù)據(jù)。

基因差異表達分析首先利用等級聚類方法對樣本進行樣本聚類和基因聚類，評價樣本的相互聚類關(guān)系；使用Multiple Experiment Viewer(MEV)軟件中的Significance Analysis of Microarrays(SAM)計算進行基因差異表達分析。基因的顯著差異定義為Q值<0.001，倍數(shù)改變大于1.5倍。

分子信號通路分析為了對差異表達或同表型相關(guān)的基因功能進行進一步的分析，借助Affymetrix公司的NetAffy及KEGG數(shù)據(jù)庫對基因進行通路分析，借助基因本體論(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫對基因進行功能注釋。

基因與臨床表型相關(guān)性分析利用R軟件，將所有基因與腎小球濾過率(GFR)進行相關(guān)性分析，以R絕對值(|R|)>0.6，P值<0.05作為顯著相關(guān)的標準。

統(tǒng)計方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗。計量資料以百分比或構(gòu)成比表示，組間比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為統(tǒng)計學差異顯著。

結(jié)　　果

中國漢族人群和高加索人群DN患者的臨床基本資料本研究共納入了中國漢族DN患者29例，高加索DN患者21例。高加索人群腎小球基因表達數(shù)據(jù)分別來源于歐洲和美國。

高加索人群DN患者的病情表現(xiàn)相對較嚴重，其血清肌酐水平較高、eGFR相對較低。但兩組蛋白尿水平和體質(zhì)量指數(shù)并無明顯差異(表1)。

表1　兩個人種糖尿病腎病患者的基本臨床數(shù)據(jù)

eGFR：估算的腎小球濾過率

歐洲和美國來源的高加索人群腎小球全基因組表達數(shù)據(jù)整合由于高加索人群DN組和對照組的數(shù)據(jù)分別來源于歐洲和美國高加索人群。為將其作為一個整體數(shù)據(jù)進行比較分析，我們需要利用對兩組全基因組表達數(shù)據(jù)進行整合。

在兩者數(shù)據(jù)整合之前的PCA結(jié)果顯示，歐洲和美國來源的高加索人群DN患者和對照組的腎小球全基因組表達數(shù)據(jù)被分為三個不同的簇，且相互之間并無交集(圖1A)。在整合之后的PCA顯示，所有高加索DN患者腎小球全基因組表達數(shù)據(jù)聚集為一簇，且同對照組之間存在明顯界限(圖1B)。

圖1　兩組不同來源的高加索人群腎小球全基因組表達數(shù)據(jù)在批次校正前后的PCA結(jié)果

兩個人種DN患者差異表達基因比較分析分別對中國漢族人群和高加索人群DN患者的腎小球全基因組表達數(shù)據(jù)進行差異表達分析。在中國漢族人群中，共有565個基因在DN患者和正常對照之間出現(xiàn)差異表達(Q<0.001，變化倍數(shù)>1.5)，其中下調(diào)139個，上調(diào)426個。在高加索人群中，共有775個基因出現(xiàn)差異表達(Q<0.001，變化倍數(shù)>1.5)，其中下調(diào)225個，上調(diào)550個。

對不同人種間出現(xiàn)差異表達的基因進行比較發(fā)現(xiàn)，有200個基因在中國漢族人群和高加索人群DN患者腎小球中均發(fā)生調(diào)節(jié)，且其調(diào)節(jié)方向完全一致。

進一步通路分析顯示，在中國漢族人群DN患者的差異表達基因中共有48條通路富集(P<0.05)，而在高加索人群DN患者中有92條通路富集(P<0.05)。比較分析提示，有13條通路在兩組不同人群中均發(fā)生調(diào)節(jié)(表2)。

兩個人種DN患者同腎功能相關(guān)基因的比較分析我們對兩個人群DN患者腎小球全基因組表達數(shù)據(jù)與腎臟功能指標——eGFR進行了相關(guān)性分析。在中國漢族DN患者腎小球全基因組表達數(shù)據(jù)中，與eGFR水平相關(guān)的基因共225個(FDR<0.01，|R|>0.60)，其中負相關(guān)的基因186個，正相關(guān)的基因39個。在高加索人群DN患者腎小球全基因組表達數(shù)據(jù)中，與eGFR水平相關(guān)的基因共有293個基因(P<0.05)。比較分析提示，共有55個基因在兩個人群均與eGFR相關(guān)(P<0.05)(表3)。

討　　論

DN發(fā)生和發(fā)展受到遺傳背景因素的影響，不同人種之間其具體分子機制仍值得探索。利用高通量的全基因組表達譜檢測和分析技術(shù)，比較分析中國漢族人群和高加索人群DN患者的腎小球內(nèi)發(fā)生差異表達的基因及其分子信號通路的異同，有助于發(fā)現(xiàn)在不同人種間DN發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)共同變化的基因及潛在的分子機制；同時，揭示在不同人種中與DN患者疾病進展的臨床表型相關(guān)的基因，有助于發(fā)現(xiàn)判斷DN疾病進展的新型標志物。

表2　中國漢族和高加索糖尿病腎病患者同時出現(xiàn)調(diào)節(jié)的部分分子信號通路

IL:白細胞介素;NF-κB:核因子κB;EGF:表皮生長因子;CBL:小屋B系淋巴瘤;TNFR2:腫瘤壞死因子受體2

表3　中國漢族人群及高加索人群中均與eGFR明顯相關(guān)的部分基因

eGFR：估算的腎小球濾過率

本研究首次利用中國漢族人群和高加索人群DN患者及正常對照組的微分離腎小球，進行了全基因組表達數(shù)據(jù)比較分析，以期發(fā)現(xiàn)相同的基因表達及其分子通路的調(diào)節(jié)。為避免和消除檢測誤差，我們首先對高加索人群的全基因組表達數(shù)據(jù)進行了批次校正。數(shù)據(jù)整合后的PCA結(jié)果顯示，高加索人群DN組和對照組在表達方式上存在差異。最終本研究共納入中國漢族人群和高加索人群的DN患者分別為29例和21例。相較于漢族DN患者，高加索DN患者的eGFR更低，腎功能損傷更重，這與歐美國家DN患者腎活檢的時間點有關(guān)。但本研究的重點在于尋找兩組不同人種DN患者腎小球內(nèi)共同的基因表達和信號通路調(diào)節(jié)。在其病情程度不同的情況下，兩組人種間仍存在的共同調(diào)節(jié)的基因和通路，更說明其在DN發(fā)生發(fā)展中的重要性。

漢族人群中與對照組比較，DN患者的腎小球內(nèi)有565個基因出現(xiàn)差異表達；而高加索人群中，與對照組相比，有775個基因在其DN患者腎小球中出現(xiàn)差異表達。比較分析顯示，有200個基因和13條分子通路在中國漢族人群和高加索人群DN患者的腎小球內(nèi)均出現(xiàn)調(diào)節(jié)。

這200個共同差異表達的基因和13條共同調(diào)節(jié)的分子信號通路體現(xiàn)了漢族人群和高加索人群在DN發(fā)生發(fā)展過程中所存在的共同分子機制。對13條分子通路的功能分析提示，其中大一部分涉及免疫炎癥反應(yīng)，包括B細胞受體信號通路、樹突狀細胞調(diào)節(jié)TH1和TH2發(fā)育通路、白細胞介素17(IL-17)信號通路和IL-12信號通路、腫瘤壞死因子受體2(TNFR2)信號通路等。免疫炎癥反應(yīng)在組織的損傷和修復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用。在組織損傷時，組織釋放促炎癥因子，炎癥細胞[如淋巴細胞、單個核細胞、樹突狀細胞(DCs)]順著化學介質(zhì)的濃度不同，逐漸浸潤到損傷部位并被激活[1]。激活后的炎癥細胞可分泌組織損傷因子，如活性氧產(chǎn)物(ROS)和數(shù)種生長因子[2,3]，持續(xù)導(dǎo)致機體的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，在不同人種DN患者腎小球內(nèi)發(fā)生調(diào)節(jié)的通路多為與免疫細胞的激活和炎癥介質(zhì)介導(dǎo)相關(guān)的信號通路等，這符合慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程，也證實了慢性免疫炎癥反應(yīng)在DN發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。

TNFR2信號通路在不同人種DN患者腎小球內(nèi)均出現(xiàn)明顯調(diào)節(jié)。腫瘤壞死因子α(TNF-α)的編碼基因是TNFR2信號通路中的關(guān)鍵基因，既往研究證實，在糖尿病小鼠模型的腎臟中，TNF-α的表達上調(diào)[4]，其作用包括促進局部的ROS產(chǎn)生[5-7]，增加腎臟對蛋白的通透性[7]，介導(dǎo)細胞毒性、凋亡和壞死等過程[8]。TNF-α可導(dǎo)致單個核-巨噬細胞系的聚集，通過調(diào)節(jié)血流動力學影響GFR，還可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞通透性的改變。在2型糖尿病的患者中，其血漿中的TNF-α的水平高于非糖尿病患者的3～4倍，而具有微量白蛋白尿的患者，其水平高于無蛋白尿的患者[9,10]，研究還證實，尿液中的TNF-α與DN疾病的進展明顯相關(guān)[11]。針對這些免疫炎癥反應(yīng)通路，開發(fā)合適的干預(yù)藥物，將是未來DN患者治療的一個重要方向。除上述免疫炎癥通路外，小屋B系淋巴瘤(CBL)介導(dǎo)的配體誘導(dǎo)的表皮生長因子(EGF)受體下調(diào)通路和過氧化物酶體增殖物通過過氧化物酶體增殖物活化受體α(PPARα)調(diào)節(jié)基因的信號通路等也出現(xiàn)在共同調(diào)節(jié)的基因通路列表中，這些通路在既往也被證實同DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

為進一步觀察DN患者腎小球內(nèi)基因表達與腎功能的關(guān)系，我們分別利用兩個人種DN患者的腎小球全基因組表達數(shù)據(jù)與eGFR進行了相關(guān)性分析。在中國漢族人群中和高加索人群中，分別有225個和293個基因與患者eGFR的變化相關(guān)。比較發(fā)現(xiàn)，共55個基因在兩個人種中均與eGFR密切相關(guān)。其中CRISPLD2、SPON1和LUM三種基因在中國漢族人群和高加索人群中同DN患者的eGFR的相關(guān)性均>0.6。這三種基因具有作為預(yù)測DN患者疾病進展的潛力，但是其準確性和精確度仍需要進行一步的研究驗證。上述在不同人種中均與eGFR密切相關(guān)的基因參與DN腎功能調(diào)節(jié)的具體機制仍有待深入研究。其中SPON1基因，既往研究中被認為是高血壓相關(guān)基因[12]，并且在鹽和水的代謝中發(fā)揮作用，其編碼的F-脊椎蛋白，是一種多功能蛋白，在其羧基末端含有6個TSR，在其氨基末端含有兩個獨特的區(qū)域。F-脊椎蛋白既往被認為是底板源性黏附蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中高表達，且在成熟神經(jīng)組織中并不高表達，其僅高表達于發(fā)育或是受損的神經(jīng)組織[13-15]。因此，其上調(diào)可能同感覺神經(jīng)再生有關(guān)。而有研究者推論在腎臟疾病發(fā)生過程中，F(xiàn)-脊椎蛋白變化可調(diào)節(jié)腎臟內(nèi)壓力，與腎臟功能的調(diào)節(jié)相關(guān)[16]。LUM編碼的蛋白表達于腎臟的內(nèi)皮細胞，有研究認為其在維持腎臟濾過屏障中發(fā)揮了重要的作用，與腎臟的選擇性濾過密切相關(guān)[17]。

在兩個人種中與eGFR相關(guān)的基因還包括編碼足細胞特異性蛋白的基因PLA2R1，其編碼的磷脂酶A2受體的抗體是導(dǎo)致原發(fā)性膜性腎病的重要原因之一，但其在DN發(fā)生和發(fā)展中的作用仍不清楚。此外，Wnt/β-catenin通路中的多種蛋白編碼基因如WNT2B、WNT4和CTNNBIP1等均與DN患者的eGFR存在明顯相關(guān)性，提示W(wǎng)nt/β-catenin在DN疾病進展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。既往有研究顯示，在DN等疾病中，足細胞內(nèi)存在Wnt1上調(diào)和β-catenin激活，可抑制足細胞表面特異性蛋白nephrin的表達，介導(dǎo)足細胞損傷[18]。細胞足細胞內(nèi)特異性的高表達Ctnnb1，可導(dǎo)致基膜異常、蛋白尿和腎小球損傷，而敲除足細胞內(nèi)的Ctnnb1同樣可導(dǎo)致DN表型。高表達Ctnnb1的足細胞，其活動性降低，并且與基質(zhì)的黏附能力下降[19]。除足細胞外，Wnt/β-catenin通路的調(diào)節(jié)還與高糖情況下系膜細胞表型改變密切相關(guān)。因此，我們有理由相信，在糖尿病高糖背景存在的情況下，Wnt/β-catenin中的關(guān)鍵分子，如WNT2B、WNT4和CTNNBIP1等出現(xiàn)調(diào)節(jié)，引起足細胞和系膜細胞的表型變化及損傷，進而影響患者腎臟功能。因此，糾正Wnt/β-catenin通路的異常調(diào)節(jié)，可能成為潛在的DN分子治療靶點，而WNT2B、WNT4和CTNNBIP1等基因能否作為DN患者疾病進展分子標志物也值得進一步驗證。

綜上所述，本研究通過比較中國漢族人群和高加索人群DN患者腎小球全基因組表達數(shù)據(jù)的差異，揭示了在兩個人種DN患者腎小球內(nèi)發(fā)生共同調(diào)節(jié)的一系列基因及其分子信號通路，證實了免疫炎癥通路在兩個人種DN的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮了重要作用。針對在DN患者中發(fā)生明顯調(diào)節(jié)的分子信號通路，開發(fā)合適分子干預(yù)藥物，可能會是未來DN患者治療的一個重要研究方向。同時，本研究還揭示了CRISPLD2、SPON1、LUM等55個與兩個人種DN患者腎功能的變化存在明顯相關(guān)性，其中部分基因涉及的病理生理學過程可能參與了DN的疾病進展，但其中大部分基因在DN或其他腎臟疾病進展過程中的作用尚未被闡明，其具體分子機制尚待進一步研究。

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