何　靜　夏　虹　張昌明　劉志紅　施少林

線粒體是真核細胞內(nèi)主管能量代謝的細胞器。不同類型細胞內(nèi)線粒體的數(shù)量從幾百個到幾千個不等。線粒體DNA(mtDNA)是位于線粒體內(nèi)裸露的雙鏈環(huán)狀DNA分子，通常每個線粒體含有2～10個拷貝[1]。人類mtDNA全長16.6 Kb，含37個基因，分別編碼13個蛋白、22個線粒體tRNA和2個線粒體rRNA。線粒體功能的實現(xiàn)依賴于mtDNA基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄[2]，因而細胞內(nèi)mtDNA數(shù)量變化必然引起線粒體功能的改變。線粒體是氧化磷酸化反應(yīng)的中心，可產(chǎn)生大量自由基，對mtDNA造成損傷；加之mtDNA缺乏核DNA所具有的組蛋白保護及完備的DNA損傷修復(fù)機制，因而比基因組DNA更易受到損傷。損傷的mtDNA通過自噬途徑降解，細胞內(nèi)mtDNA總數(shù)量減少，從而影響線粒體功能[3-5]。

細胞內(nèi)及循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)的變化與人類多種疾病相關(guān)，包括糖尿病及其并發(fā)癥[6]、肥胖[7]、腫瘤[8]、HIV感染[9,10]等。此外，mtDNA拷貝數(shù)變化也與生長發(fā)育[11]、生育[12]、老年化[13]、環(huán)境變化[14]和體育鍛煉[15]相關(guān)。然而，mtDNA拷貝數(shù)變化能否反映腎臟細胞的損傷、成為腎臟疾病的生物標(biāo)志分子，目前尚無此類研究。為解決這些問題，我們首先嘗試建立一種精確、穩(wěn)定和經(jīng)濟地測定mtDNA拷貝數(shù)的方法。

目前，文獻中測定mtDNA拷貝數(shù)的方法主要是Taqman探針法實時(Real-time)PCR[16]。但是，Taqman探針價格昂貴，不適宜高通量檢測。與Taqman探針相比，SYBR Green Ⅰ 染料法成本低廉，使用簡便，適宜大批樣本檢測。為此，本研究旨在建立mtDNA拷貝數(shù)的SYBR Green Ⅰ實時定量PCR方法，并探討其在腎臟疾病診斷及足細胞損傷檢測中的應(yīng)用。

材料與方法

主要試劑和儀器DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)，Nco Ⅰ限制性內(nèi)切酶(NEB)，引物合成(Invitrogen)，Taq DNA聚合酶、SYBR green real-time PCR kit(寶生物工程)，PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工)，pEASY-T5 Zero Cloning Kit(北京全式金)，瓊脂糖(Biowest)，Applied Biosystem 7900HT PCR儀，Bio-Rad水平電泳儀，Gold-SIM凝膠成像系統(tǒng)，OptimaTML-XP超速離心機。

mtDNA標(biāo)準(zhǔn)品制備我們將mtDNA片段克隆至質(zhì)粒載體作為拷貝數(shù)定量的標(biāo)準(zhǔn)品。其制備方法如下：取健康成人外周全血200 μl，按照Blood mini DNA isolation kit(Qiagen)操作說明提取全基因組DNA(含mtDNA)。利用獲得的全基因組DNA作為模板，進行普通PCR反應(yīng)，引物序列為mt-DNA片段PCR前引物(Mito-F)：5′-C￣A￣C￣T￣T￣T￣C￣C￣A￣C￣A￣C￣A￣G￣A￣C￣A￣T￣C￣A-3′ ；mt-DNA片段PCR后引物(Mito-R)：5′-T￣G￣G￣T￣T￣A￣G￣G￣C￣T￣G￣G￣T￣G￣T￣T￣A￣G￣G￣G-3′，產(chǎn)物127 bp，反應(yīng)體系50 μl：5 μl 10倍濃縮PCR緩沖液(含2 mmol/L Mg2+)，4 μl dNTP (每種dNTP 2.5 mmol/L)，1 μl上游、下游引物(10 mmol/L)，1 μl DNA 模板，加ddH2O補足至50 μl。PCR熱循環(huán)：95℃ 2 min模板變性后，進行35個95℃/30s、55℃/30s、72℃/30s循環(huán)，于72℃ 充分延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，驗證擴增產(chǎn)物。

新鮮擴增的產(chǎn)物利用生工PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化，并用Nanodrop 2000測定濃度。按pEASY-T5 Zero Cloning Kit操作說明，按比例加入目的片段和pEASY-T5 Zero T載體，室溫反應(yīng)5 min。將該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，用氨芐青霉素平板選擇轉(zhuǎn)化子，挑取轉(zhuǎn)化子菌落培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，進行PCR、Nco Ⅰ 酶切及測序鑒定。經(jīng)鑒定正確的陽性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品備用。

實時定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作采用SYBR Green Ⅰ 染料法，在Applied Biosystem 7900HT PCR儀建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)體系為25 μl，以出現(xiàn)最小的閾值循環(huán)數(shù)(CT值)和最高的熒光值及不出現(xiàn)非特異的擴增產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)，分別對模板濃度、退火溫度和引物濃度進行優(yōu)化。將制備的mtDNA質(zhì)粒用Nanodrop 2000測定OD 260 nm計算質(zhì)粒濃度，質(zhì)粒OD 260 nm/OD 280 nm比值在1.8～2.0方可用來制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用雙鏈DNA拷貝數(shù)計算器 (http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html)將質(zhì)粒質(zhì)量換算成拷貝數(shù),再用無DNase ddH2O 10倍梯度稀釋成107、106、105、104、103、102拷貝各5 μl。以此為模板，建立25 μl反應(yīng)體系，根據(jù)優(yōu)化的反應(yīng)條件，在Applied Biosystem 7900HT PCR儀上擴增。反應(yīng)結(jié)束后，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，利用Excel軟件計算標(biāo)準(zhǔn)曲線。

實時定量PCR產(chǎn)物的特異度及重復(fù)性試驗以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進行普通PCR擴增，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析；進行實時定量PCR擴增，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析和熔解曲線分析。重復(fù)性檢測時，將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成3個濃度梯度，組內(nèi)重復(fù)性試驗時，每個稀釋度重復(fù)10孔；組間重復(fù)性試驗時，同 1次反應(yīng)每個稀釋度重復(fù)4孔，重復(fù) 4次反應(yīng)。

血清DNA提取采集健康對照和局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)患者各2 ml全血，室溫放置30 min，16 000 g，4℃離心10 min，每個研究對象取200 μl血清，按照DNeasy Blood & Tissue Kit(#69504)說明書進行DNA提取，用200 μl AE 緩沖液進行洗脫。提取的DNA放-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

微囊泡(MV)提取

人永生化足細胞(HPC)MV提取參考Thery等[17]方法，足細胞經(jīng)37℃、5% CO2培養(yǎng)分化8～10d后，吸除RIPM1640完全培養(yǎng)基，加入20 ml無血清RIPM1640培養(yǎng)基，設(shè)立對照組和嘌呤霉素氨基核苷(PAN)組。PAN組予終濃度為50 μg/ml 的PAN處理24h后，將培養(yǎng)上清移入離心管，于4℃依次進行下列離心：2 000 g，20 min；10 000 g，30 min；100 000 g，70 min。最后一次離心的沉淀即為MV，用200 μl HBSS反復(fù)吹吸溶解。留取部分樣品用于蛋白濃度測定，其余部分放-80℃?zhèn)溆谩?/p>

尿液MV提取參考Gonzales等[18]方法，收集健康成人和FSGS患者尿液各30 ml，加入蛋白酶抑制劑，于4℃進行系列梯度離心：17 000g，10 min；200 000 g，1h。離心結(jié)束后，用200 μl PBS反復(fù)吹吸溶解。留取部分樣品測定蛋白濃度，其余部分放-80℃?zhèn)溆谩?/p>

MV中DNA提取取溶解的MV 200 μl，加入DNase Ⅰ (Ambion 2222) 1 μl，37℃孵育30 min，然后75℃ 10 min滅活DNase Ⅰ，再按照DNeasy Blood & Tissue Kit(#69504)說明書進行DNA提取，用100 μl AE buffer 進行洗脫。獲得的DNA用Picogreen dsDNA quantification kit定量。

統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均為3次獨立實驗結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備本研究中所用pEASY-T5 Zero T載體全長3 831 bp，在其克隆位點上下游存在M13F/M13R通用測序位點。當(dāng)127 bp的mtDNA片段插入后，M13F/M13R測序引物的PCR產(chǎn)物大小會相應(yīng)增加(約300 bp)。該對引物對陽性克隆(Mito質(zhì)粒)的PCR產(chǎn)物凝膠分析結(jié)果與預(yù)期相符(圖1A)。Mito質(zhì)粒經(jīng)NcoI酶切后，線性化片段約4 kb(圖1B)。最后，Mito質(zhì)粒的測序結(jié)果(圖1C)證實了127 bp mtDNA片段的存在。因此，我們成功構(gòu)建了mtDNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

圖1　Mito質(zhì)粒PCR產(chǎn)物(A)、限制酶酶切(B)及測序圖譜(C)分析

mtDNA定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作為將質(zhì)粒質(zhì)量換算成拷貝數(shù)，用無DNase ddH2O 10倍梯度稀釋成107、106、105、104、103、102、101拷貝各5 μl。在25 μl的反應(yīng)體系內(nèi)，加入12.5 μl 2X SYBR mix、0.5 μl ROX dye、0.25 μl上、下游引物(Mito-F，Mito-R，10 μmol/L)、5 μl 上述質(zhì)粒DNA稀釋液、6.5 μl ddH2O；熱循環(huán)條件為95℃/30s預(yù)變性，40個循環(huán)的95℃/5s和60℃/30s。mtDNA絕對定量的典型熔解曲線，擴增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

熔解曲線表明擴增產(chǎn)物形成單一的特異性熔解峰，Tm值在83.3～83.5℃(圖2A)；qPCR即real-time PCR擴增樣品經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，僅含與預(yù)期目的片段大小一致的擴增產(chǎn)物，無其他產(chǎn)物出現(xiàn)(圖2B)。擴增曲線顯示，除最高稀釋度樣品(101拷貝/5 μl)外，所有樣品的目的產(chǎn)物呈指數(shù)擴增，即擴增效率為100%，因此，該方法的mtDNA檢測下限為102拷貝/5 μl(圖2C)。標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，標(biāo)準(zhǔn)品模板濃度與CT值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2均>0.99，斜率在3.0～3.3(圖2D)。對三個濃度梯度進行重復(fù)性分析，結(jié)果表明無論是組內(nèi)差異還是組間差異均<3%(表1)。

圖2　線粒體DNA拷貝數(shù)定量

表1　實時定量PCR重復(fù)性檢測

FSGS患者血清mtDNA拷貝數(shù)利用所建立的mtDNA拷貝數(shù)定量方法，我們檢測健康對照(n=6)和FSGS患者(n=10)血清mtDNA拷貝數(shù)，結(jié)果顯示FSGS患者血清mtDNA拷貝數(shù)較健康對照明顯下降，(P<0.05)(圖3)。

圖3　健康對照及FSGS患者血清mtDNA拷貝數(shù)比較

FSGS患者尿液MV來源mtDNA的變化尿液MV中包含的蛋白、microRNA、mRNA、DNA等均是潛在的生物標(biāo)志物[21,22]。我們猜測，尿液MV可能含有mtDNA，且尿液中MV mtDNA的濃度可能與疾病狀態(tài)相關(guān)。為證明該猜測，本研究利用建立的mtDNA定量方法對FSGS患者尿液MV mtDNA的含量進行檢測。留取5例正常人對照和5例FSGS患者尿液30 ml，提取MV及其DNA，取相同體積DNA樣品進行qPCR，結(jié)果顯示，F(xiàn)SGS組的尿液MV mtDNA濃度明顯高于正常對照組(圖4A)。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SGS患者尿液MV的含量也顯著高于正常對照(根據(jù)MV蛋白總量測定，圖4B)，提示FSGS患者MV mtDNA濃度的升高可能主要是由MV含量的增加造成。

圖4　FSGS患者尿液MV中mtDNA變化

PAN處理的足細胞所分泌的MV中mtDNA的變化近年來，已有數(shù)篇文獻提及體外培養(yǎng)的細胞分泌的MV中含有mtDNA[19,20]。我們推測，受損傷刺激的足細胞所分泌的MV，其mtDNA含量可能出現(xiàn)變化，從而反映足細胞的損傷而成為標(biāo)志物。為此，我們利用所建立的mtDNA定量方法，對正常培養(yǎng)的和PAN刺激的HPC所分泌的MV進行mtDNA的定量檢測和比較，結(jié)果顯示正常培養(yǎng)的HPC的MV確實含有mtDNA，約為1 000 個拷貝/ng MV總DNA量。PAN處理HPC 24h后，分泌的MV中mtDNA水平則明顯下降(圖5)。同時，我們還對PAN處理的HPC內(nèi)mtDNA含量進行了測定，結(jié)果顯示PAN同樣降低了HPC細胞內(nèi)的mtDNA拷貝數(shù)(圖6)。這一結(jié)果表明，MV內(nèi)mtDNA含量的變化能反映細胞內(nèi)的mtDNA含量的變化。

圖5　PAN處理的HPC分泌的MV中mtDNA變化情況

圖6　PAN處理的HPC內(nèi)mtDNA拷貝數(shù)變化情況

討　　論

疾病的診斷及分期有賴于良好的生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，而越來越多的證據(jù)表明循環(huán)mtDNA水平與多種疾病的發(fā)生發(fā)展存在著關(guān)聯(lián)性，同時由于其濃度及拷貝數(shù)較高，方便檢測，從而有望成為新的生物標(biāo)志物。Malik等[23]指出由于基因組存在著大量mtDNA的假基因，所以在進行實時qPCR定量時候，引物的選擇顯得尤為重要，該作者通過對mtDNA的片段化，再將其與BLAST數(shù)據(jù)庫比對，最后獲得兩對mtDNA特異性的引物。本研究即采用其中一對，以外周血DNA為模板PCR擴增出目的片段，連接T載體，構(gòu)建了質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，并且制作了基于SYBR Green Ⅰ實時PCR的mtDNA定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品與CT值的線性關(guān)系很好，直線回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2>0.99。此外，該方法敏感度高 ，檢出下限達到100拷貝/5μl；特異性強，擴增產(chǎn)物熔解曲線僅單一的熔解峰，瓊脂糖凝膠電泳僅唯一的特異性條帶；重復(fù)性好，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品組內(nèi)及組間變異系數(shù)均<3%。

已有研究證實，創(chuàng)傷[24,25]、酸堿燒傷[26]、重癥[27]、腫瘤[8]患者循環(huán)mtDNA升高，同時在大鼠缺血性休克模型中，循環(huán)mtDNA水平可持續(xù)升高一周左右[28]。Venhoff等[29]對77例系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者循環(huán)mtDNA水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，所有患者循環(huán)mtDNA水平均升高。那么，腎臟疾病患者的循環(huán)mtDNA水平是否異常呢？本研究利用建立的方法,對6例健康對照及10例FSGS患者血清mtDNA水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SGS患者血清mtDNA均較健康對照下降。當(dāng)然，由于樣本量太小，該結(jié)果尚需大樣本驗證,但至少可以明確腎臟損傷時，循環(huán)mtDNA水平不一定升高，甚至可以是下降的。對循環(huán)mtDNA水平變化的研究可能加深對腎臟疾病發(fā)病機制的了解。

MV是近年來發(fā)現(xiàn)的一種細胞間信號交流的新方式，直徑在40～1 000 nm[30]。2009年,Guescini等[19，20]首先提出培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞和膠質(zhì)母細胞分泌的MV中含有mtDNA,后續(xù)他們又證實了C2C12肌成纖維細胞分泌的MV中含有mtDNA,并提出MV裝載mtDNA可能作為細胞間mtDNA平行轉(zhuǎn)運的方式，用以修復(fù)受體細胞中mtDNA的損傷。本研究也證實，體外培養(yǎng)的足細胞分泌的MV中也含有mtDNA,提示細胞分泌的MV包含mtDNA可能是普遍現(xiàn)象，而并不是某種或某一類細胞所特有。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)PAN處理足細胞后，不僅細胞分泌的MV中mtDNA拷貝數(shù)下降，而且足細胞內(nèi)的mtDNA拷貝數(shù)也下降。因此，足細胞MV中的mtDNA含量變化有可能反映足細胞損傷狀態(tài)，并成為其損傷標(biāo)志物。我們進一步推測，通過分離腎臟疾病患者尿液足細胞來源的MV，并測定其mtDNA的含量，有可能推斷其足細胞的損傷狀態(tài)。由于Hagiwara等[31]發(fā)現(xiàn)PAN大鼠FSGS模型無論是腎皮質(zhì)還是腎小球中mtDNA拷貝數(shù)均下降，與本研究體外足細胞損傷模型的結(jié)果一致，我們可以利用該模型，分離尿液中足細胞來源的MV，分析其mtDNA水平，從而確定在腎臟疾病患者，尿液足細胞MV 的mtDNA能否作為足細胞損傷的生物標(biāo)志物。

尿液MV主要由泌尿系統(tǒng)上皮細胞分泌，其中包含的蛋白質(zhì)、microRNA、mRNA均是腎臟疾病潛在的生物標(biāo)志物[22,32]。Sharma等[33]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病患者尿液MV中mtDNA拷貝數(shù)下降，提示尿液MV mtDNA是潛在的腎臟疾病的生物標(biāo)志物。然而，Kitada等[34]研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病模型db/db小鼠腎臟中mtDNA拷貝數(shù)較db/m正常對照鼠增加；Malik等[35]也發(fā)現(xiàn)2型糖尿病GK大鼠模型中，腎組織中mtDNA拷貝數(shù)也增加，因此，尿液MV中mtDNA含量不能反映糖尿病腎組織mtDNA的變化，原因可能是尿液MV來源復(fù)雜。前文提到，提取尿液中足細胞來源的MV，并分析其mtDNA的變化，有可能反映足細胞內(nèi)mtDNA的水平及損失情況。本研究利用所建立的方法對FSGS患者尿液MV中mtDNA拷貝數(shù)進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FSGS患者尿液MV來源的mtDNA含量較健康對照明顯上升，但同時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SGS患者尿液MV的含量也上升，提示FSGS患者尿液MV來源的mtDNA的升高主要是由MV的升高造成的。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)用尿液MV中總DNA量校準(zhǔn)尿液MV中的mtDNA量時，F(xiàn)SGS患者與健康對照無明顯差異(數(shù)據(jù)未顯示)，可能的原因是FSGS患者尿液MV中的總DNA量及種類的變化復(fù)雜，與尿液MV mtDNA的含量不是呈簡單的線性關(guān)系有關(guān)，此外，本研究樣本量偏小，也是需要考量的因素之一。總之，尿液中總MV的mtDNA是否與腎臟疾病相關(guān)，尚需進一步確定。

綜上所述，腎臟疾病可能與mtDNA水平的變化相關(guān)聯(lián)，因此，血清，血漿，尿液，腎組織細胞中的mtDNA有可能成為腎臟疾病診斷的生物標(biāo)志物。本研究建立的mtDNA拷貝數(shù)測定方法為進一步開展這項研究奠定了基礎(chǔ)。

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