駱杰偉　孟曉嶸　鄭星宇　魏世超　胡　丹　楊　笑　張雪梅　范丁前

常染色體顯性遺傳性多囊腎病(ADPKD)是很常見的單基因遺傳性疾病，是終末期腎病(ESRD)的最常見的遺傳病因[1]，在全世界范圍內(nèi)有0.12億人發(fā)病[2]；中國腎移植科學(xué)登記系統(tǒng)數(shù)據(jù)顯示，囊性腎臟病(3.5%)占中國ESRD第四位病因[3]。目前至少發(fā)現(xiàn)3個基因與本病有關(guān)，已明確的是定位于16p13.3的PKD1基因和定位于4q21的PKD2基因，分別編碼多囊蛋白1(PC1)和多囊蛋白2(PC2) 。與PKD1突變有關(guān)的患者至少占85%，而與PKD2有關(guān)的≤15%；尚有可能不明確的第三種基因與之有關(guān)。PKD1患者較PKD2患者病情重，發(fā)病早[4,5]。此研究試圖用華大基因(BGI)外顯子序列捕獲技術(shù)平臺檢測一個多囊腎家系突變方式。

對象與方法

研究對象本家系先證者來自于福建省立醫(yī)院住院患者，44歲男性，漢族，臨床表現(xiàn)為腰酸、肉眼血尿、腹脹、高血壓、泌尿系感染、雙腎多發(fā)結(jié)石、胸腔積液等。并收集本家系相關(guān)成員共8個血樣及臨床資料，其中包括先行收集的已故的先證者母親Ⅱ4，而先證者妹妹(40歲)Ⅲ5在同期表現(xiàn)出上述癥狀。多囊腎診斷參考Ravine等[6]提出超聲診斷：(1)<30歲患者單側(cè)或雙側(cè)有≥2個囊腫；(2)30～59歲患者雙側(cè)腎囊腫≥2個；(3)≥60歲患者雙側(cè)腎囊腫≥4個；(4)如果具有家族史或多囊肝等腎外表現(xiàn)或基因檢測，診斷標(biāo)準(zhǔn)可適當(dāng)放寬。

經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意，受試者均簽署知情同意書。

研究方法

臨床表型檢測根據(jù)先證者及家系成員臨床表現(xiàn)行肝腎彩超、電子計算機X射線斷層掃描技術(shù)(CT)或核磁共振等檢測，采集血、尿常規(guī)、生化全套等。

基因組DNA的提取抽取先證者15 ml外周血及家系其他7名成員抽取2 ml外周血，按試劑盒(Omega E.Z.N.A.? Tissue DNA Kit)說明書方法提取基因組DNA。

Illumina測序[7,8]及生物信息學(xué)分析[9](1)樣品檢測：先證者DNA樣品由Nanodrop 2000檢測濃度，取3 μg以上DNA樣品用于DNA片段化。(2)樣品打斷：用Covaris法將DNA片段打斷至250 bp左右的片段并回收。(3)Illumina測序文庫構(gòu)建：將回收片段進行末端修復(fù)反應(yīng)，將測序特定接頭(Adapter)同末端修復(fù)產(chǎn)物進行連接反應(yīng)，根據(jù)Adapter上的通用引物結(jié)合位點進行產(chǎn)物的擴增反應(yīng)，純化回收產(chǎn)物。(4)目的基因的捕獲和富集：用集合了多種基因的DNA捕獲芯片進行包括目的基因PKD1、PKD2在內(nèi)的多個基因片段進行富集，富集產(chǎn)物用Illumina 2000(Hiseq2000測序儀)進行測序反應(yīng)。(5)數(shù)據(jù)分析：原始圖像文件經(jīng)過Illumina base calling Software 1.7進行堿基讀取，獲得讀長為90 bp雙末端序列(reads)。去除低質(zhì)量和污染的reads，去除接頭Adapter序列得到純化數(shù)據(jù)進行序列比對分析，用soap軟件分析拷貝數(shù)、多態(tài)性(SNP)和插入/缺失(INDEL)，并且進行注釋篩選可疑致病突變。并經(jīng)SIFT(http://sift.jcvi.org/)和Polyphen軟件(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/)對其進行蛋白功能預(yù)測。上述部分由深圳華大基因研究院協(xié)作按照其操作標(biāo)準(zhǔn)完成。

Sanger測序驗證 (1)引物合成：PKD1基因序列來自GenBank(NM_000296)，PKD1基因10號外顯子引物測序來自文獻[10]。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。上游序列：5′-G￣C￣A￣G￣G￣C￣A￣G￣T￣T￣G￣G￣G￣C￣A￣T￣C￣T￣C￣T￣G-3′,下游序列：5′-G￣A￣C￣C￣C￣T￣G￣G￣G￣C￣A￣G￣C￣A￣G￣A￣C￣A￣G-3′。(2)PCR產(chǎn)物擴增：25 μl的反應(yīng)體系中包含10×擴增緩沖液2.5 μl，dNTP (2.5 mmol/l) 2 μl，F(xiàn)orward primer(3 mmol/L)3 μl，Reverse primer(3 mmol/L)3 μl，DNA模板1 μl，Ex Taq 0.2 μl，H2O 18.3 μl。在PCR儀(PTC-200 PCR，BIO-RAD)上94℃變性5 min，按照94℃變性40s，57℃退火40s，72℃延伸60s條件循環(huán)35次后72℃延伸10 min。(3)PCR產(chǎn)物的純化和測序：PCR產(chǎn)物采用Omega公司E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit按照操作說明純化，測序按照BigDye Terminator v1.1試劑盒PCR產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)流程操作。(4)DNA測序結(jié)果分析：采用DNAMAN Version 5.2.2與正常序列比對。當(dāng)懷疑雜合缺失或插入時，將PCR產(chǎn)物連接在PGEM-T Easy(Promega)載體上挑選亞克隆進行測序。

結(jié)　　果

臨床資料經(jīng)臨床調(diào)查，發(fā)現(xiàn)此家系有4個發(fā)病者(圖1)；先證者(Ⅲ3)以“腰酸脹、排肉眼血尿、尿頻、尿痛、尿頻”為主因就診，既往發(fā)現(xiàn)“多囊腎、多囊肝”10年，入院前5年曾于外院行“雙側(cè)多囊腎去頂術(shù)”；已故母親死于“肝腎聯(lián)合移植術(shù)”，術(shù)前診斷“多囊腎、多囊肝、肝功能不全、尿毒癥”，先證者妹妹(Ⅲ5)也發(fā)現(xiàn)“多囊腎、多囊肝”10年，3年前行“左側(cè)多囊腎去頂術(shù)”，腎功能正常；經(jīng)查先證者血肌酐104 μmol/L，尿素痰6.9 mmol/L，血尿酸392 μmol/L，谷丙轉(zhuǎn)氨酶15 U/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶22 U/L，谷氨酰轉(zhuǎn)移酶54 U/L，堿性磷酸酶46.0 U/L，總膽紅素12.94 μmol/L，胱抑素1.42 mg/L，糖類抗原199(Ca199)93.73 U/ml(0.0～27.0 U/ml)，D-二聚體1.48 μg/ml，血紅蛋白139 g/L，電解質(zhì)、甲狀腺功能正常；尿常規(guī)：白細胞++++，蛋白++++，潛血++++；心電圖：竇性心動過緩；彩超：雙腎多發(fā)結(jié)石，多囊肝，多囊腎，前列腺增生伴結(jié)石，膽囊、胰腺及腹膜顯示不清；血壓波動于110～130/80～95 mmHg；磁共振(MRI)示：肝臟及雙腎輪廓明顯增大，其內(nèi)可見彌漫多發(fā)大小不一類圓形囊性灶，最大徑約9.2 cm，以長T1、長T2信號為主，雙腎內(nèi)部分病灶呈T1信號。肝、腎實質(zhì)明顯受壓顯示不清，以肝左外葉殘余可見的肝實質(zhì)較多。鄰近組織明顯受壓移位或擴

張受限。掃描野內(nèi)雙側(cè)胸腔少量積液，呈長T2信號。考慮為多囊肝、多囊腎(部分腎囊腫合并出血)，雙側(cè)胸腔少量積液。此家系發(fā)病者影像均表現(xiàn)出腎外癥狀如多囊肝比多囊腎癥狀重(圖2)。

圖1　常染色體顯性遺傳性多囊腎家系圖

圖2　先證者多囊腎、多囊肝磁共振影像圖

PKD1、PKD2基因外顯子捕獲測序質(zhì)量先證者的PKD1、PKD2基因外顯子捕獲測序質(zhì)量報告圖表可見，除PKD1基因第1號外顯子外，其余外顯子的測序覆蓋均>99%(圖3)。各外顯子的平均測序深度，與測序深度中位數(shù)均比較接近，說明測序的隨機性比較好。

PKD1、PKD2基因外顯子突變分析對先證者的PKD1、PKD2基因外顯子測序深度數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析后，未發(fā)現(xiàn)存在大片缺失或重復(fù)。在PKD1基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)1個框移突變c.2085_2086insC(p.Ala696Argfs17X)，為雜合子；該突變造成PKD1基因氨基酸編碼提前終止，很可能影響其蛋白功能；其在人群中發(fā)生頻率極低。在PKD1基因編碼區(qū)還發(fā)現(xiàn)兩個錯義突變雜合子：4340C>T(p.Ala1447Val)、2216A>G (P.Arg739Gln)，經(jīng)SIFT和Polyphen對其進行蛋白功能預(yù)測，結(jié)果為無害，為已知多態(tài)性位點；及同義變異：1119T>C(p.Leu373Leu)、2670C>T (p.Asn890Asn)，其中p.Leu373Leu為為已知的多態(tài)性位點。在PKD2基因上未發(fā)現(xiàn)框移、無義、剪切、錯義或同義變異位點。

圖3　PKD1基因外顯子捕獲測序質(zhì)量報告圖表

家系成員經(jīng)Sanger測序，Ⅱ4、Ⅲ3、Ⅲ5、Ⅳ3均查出p.Ala696Argfs17X突變方式，而在Ⅱ3、Ⅲ2、Ⅳ1、Ⅳ2未查出此突變方式。因此，推測PKD1基因編碼區(qū)的框移突變c.2085_2086insC(p.Ala696Argfs17X)為此家系的致病性突變。

圖4　常染色體顯性遺傳性多囊腎先證者PKD1基因exon 10測序圖

表1　常染色體顯性遺傳性多囊腎先證者的突變方式

dbSNP頻率：dbSNP數(shù)據(jù)庫中收錄的關(guān)于此SNP的頻率信息；Hapmap頻率：Hapmap數(shù)據(jù)庫中收錄的關(guān)于此SNP在亞裔人種中的頻率信息；千人頻率：千人基因組計劃中全部測序樣本中關(guān)于此SNP的頻率信息；本地頻率：華人基因(BGI)收集的>625個正常人測序樣本中關(guān)于SNP的頻率信息

討　　論

人PKDl基因長度約52 kb，含有46個外顯子，編碼的PC1是4 302個氨基酸殘基構(gòu)成的11次跨膜的糖蛋白，由細胞外區(qū)(NH2端)、跨膜區(qū)與細胞內(nèi)區(qū)(COOH端)組成，細胞內(nèi)區(qū)含有螺旋-螺旋交互結(jié)構(gòu)，PC1分布細胞膜初級纖毛及與細胞連接處如黏附斑、橋粒等位置[11]。PC1參與細胞-細胞或細胞-基質(zhì)交互作用，PC1通過海膽卵膠受體(REJ)、G蛋白耦聯(lián)、Wnt等信號傳導(dǎo)途徑揮發(fā)作用[5]，PKD2基因長度為68 kb，含有15個外顯子，編碼的PC2，表達于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞膜底外側(cè)和初級絨毛中，含6個跨膜區(qū)域，其NH2端和COOH端均位于細胞內(nèi)，為非選擇性陽離子通道，能運載鈣離子；PC2的C端可能存在一個特定的盤繞功能域，與PC1相連形成多囊蛋白復(fù)合物[12]。PC1與PC2配合，進一步激活鈣離子通道，共同啟動由細胞外向細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，調(diào)控其他下游活性基因。ADPKD發(fā)病涉及多條信號傳導(dǎo)通路，這些通路異?？梢鹉遗萆掀ぜ毎惓Ｔ鲋撑c囊液過度分泌而導(dǎo)致囊泡發(fā)展。PKD1和PKD2基因如發(fā)現(xiàn)突變，或可導(dǎo)致PC1與PC2結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生改變，信號傳導(dǎo)通路異常，引起細胞異常增殖和囊液過度分泌而引起多囊腎與多囊肝。

搜索ADPKD突變數(shù)據(jù)庫(Version 3.0，http://pkdb.mayo.edu/)，PKD1基因有2 324個突變點，明確的致病突變有868個，包括錯義突變263個、框移突變449個、插入或缺失43個、大片缺失或重復(fù)20個及剪切突變93個； PKD2基因有278個突變點，其中致病突變有162個，包括錯義突變48個、框移突變75個、插入或缺失2個、大片缺失或重復(fù)6個及剪切突變31個。目前發(fā)現(xiàn)PKD1基因的大多突變分布在35～46外顯子單拷貝區(qū)，而5′近端區(qū)域1～34外顯子因存在同源基因多次核苷酸重復(fù)拷貝，給DNA測序及突變檢測帶來難度[13]。應(yīng)用第二代測序技術(shù)平臺提高了檢出率，PKD1、PKD2編碼區(qū)、多拷貝區(qū)和單拷貝區(qū)檢出真陽性率可分別達69.4%、50% 和100%[14]；此多囊腎家系應(yīng)用二代測序外顯子序列捕獲技術(shù)，檢測出5′近端區(qū)域區(qū)多個突變，其中p.Ala696Argfs17X參與了此多囊腎家系的發(fā)病，其余突變位點經(jīng)檢索均為多態(tài)性位點。該突變造成PKD1基因氨基酸編碼提前終止，其必然翻譯出被截短、有缺陷的蛋白質(zhì)，很可能影響其蛋白功能；此突變導(dǎo)致的ADPKD至今已發(fā)現(xiàn)有10個左右家系[15,16]，分布在不同人種。另外，這個家系病情較重，一個原因可能是p.Ala696Argfs17X位于5′近端區(qū)域，Rossetti等[17]曾報道了80個家系的324例ADPKD患者，發(fā)現(xiàn)致病突變點在5′端的患者臨床癥狀較3′端重，而進入ESRD的年齡與發(fā)生的突變位點類型無關(guān)聯(lián)，5′近端和3′端區(qū)域突變的患者進入ESRD的平均年齡分別為53和56歲(P=0.025)，到60歲腎功能尚良好的比例分別為18.9%和39.7%。

特定基因的大片段區(qū)域的傳統(tǒng)測序主要通過步行PCR法后進行毛細管測序的。但其目標(biāo)片段>500 kb時，PCR難度及測序成本較高。而單基因病的研究采用的是家系連鎖定位，最后定位區(qū)域也需要以兆(M)bp來計算的，進一步研究難度也大。近年，發(fā)展起來的第二代測序技術(shù)，基于邊合成邊測序(Sequencing by Synthesis)原理，結(jié)合基因芯片和新一代測序方法的二項高通量測序技術(shù)，產(chǎn)生了新的經(jīng)濟實惠測序技術(shù)，如目標(biāo)序列捕獲、全外顯子組捕獲技術(shù)?，F(xiàn)有的二代高通量測序平臺有：llumina Solexa HiSeq2000、Genome AnalyzerIIx、ABI SOLID4、Roche 45；其中Illumina/Solexa Genome Analyzer應(yīng)用的是合成法測序，測序用不同顏色的熒光標(biāo)記4種不同的dNTP，合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，再用計算機軟件分析這些捕捉的熒光信號，獲得DNA的序列信息。全外顯子組捕獲測序可以作為傳統(tǒng)家系定位方法的有益補充，將極大的推動遺傳疾病的研究。人類大概85%的單基因疾病突變位點位于外顯子區(qū)域，新一代測序與傳統(tǒng)全基因組測序相比，覆蓋度更廣、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性更高，更加簡便、經(jīng)濟、高效?？蓱?yīng)用于尋找復(fù)雜疾病致病基因和易感基因等的研究[18]。

目前關(guān)于多囊腎發(fā)病學(xué)說主要有：二次打擊學(xué)說、螺旋區(qū)-螺旋區(qū)相互作用、終止信號假說、齊-雜合子學(xué)說及纖毛致病學(xué)說等。我們推測這些基因突變或引起PC1功能改變，進而可能引起初級纖毛功能障礙，導(dǎo)致無法將感應(yīng)正常尿流率產(chǎn)生的終止信號傳遞給腎小管細胞，造成腎小管細胞增殖失控，囊腫不斷擴大[19]。其他具有基因多態(tài)性位點特征的錯義或突變可能在多囊腎的后天的發(fā)生發(fā)展過程中起著協(xié)同作用，值得關(guān)注。

(感謝深圳華大基因臨床檢驗中心給予的技術(shù)支持)

1Drenth JP,Martina JA,van de Kerkhof R,et al.Polycystic liver disease is a disorder of cotranslational protein processing.Trends Mol Med,2005,11(1):37-42.

2Helal I.Autosomal dominant polycystic kidney disease:new insights into treatment.Saudi J Kidney Dis Transpl,2013,24(2):230-234.

3Liu ZH.Nephrology in china.Nat Rev Nephrol,2013,9(9):523-528.

4Hateboer N,v Dijk MA,Bogdanova N,et al.Comparison of phenotypes of polycystic kidney disease types 1 and 2.European PKD1-PKD2 Study Group.Lancet,1999,353(9147):103-107.

5Bastos AP,Onuchic LF.Molecular and cellular pathogenesis of autosomal dominant polycystic kidney disease.Braz J Med Biol Res,2011,44(7):606-617.

6Ravine D,Gibson RN,Walker RG,et al.Evaluation of ultrasonographic diagnostic criteria for autosomal dominant polycystic kidney disease 1.Lancet,1994,343(8901):824-827.

7He J,Wu J,Jiao Y,et al.IgH gene rearrangements as plasma biomarkers in Non- Hodgkin’s lymphoma patients.Oncotarget,2011,2(3):178-185.

8Wu J,Matthaei H,Maitra A,et al.Recurrent GNAS mutations define an unexpected pathway for pancreatic cyst development.Sci Transl Med,2011,3(92):92ra66.

9Li R,Li Y,Kristiansen K,et al.SOAP:short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics,2008,24(5):713-714.

10 Tan YC,Michaeel A,Blumenfeld J,et al.A novel long-range PCR sequencing method for genetic analysis of the entire PKD1 gene.J Mol Diagn,2012,14(4):305-313.

11 Ibraghimov-Beskrovnaya O,Bukanov N.Polycystic kidney diseases:from molecular discoveries to targeted therapeutic strategies.Cell Mol Life Sci,65(4):605-619.

12 Tsiokas L,Kim E,Arnould T,et al.Homo- and heterodimeric interactions between the gene products of PKD1 and PKD2.Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(13):6965-6970.

13 Watnick TJ,Gandolph MA,Weber H,et al.Gene conversion is a likely cause of mutation in PKD1.Hum Mol Genet,1998,7(8):1239-1243.

14 Qi XP,Du ZF,Ma JM,et al.Genetic diagnosis of autosomal dominant polycystic kidney disease by targeted capture and next-generation sequencing:utility and limitations.Gene,2013,516(1):93-100.

15 Rossetti S,Hopp K,Sikkink RA,et al.Identification of gene mutations in autosomal dominant polycystic kidney disease through targeted resequencing.J Am Soc Nephrol,2012,23(5):915-933.

16 Audrézet MP,Cornec-Le Gall E,Chen JM,et al.Autosomal dominant polycystic kidney disease:comprehensive mutation analysis of PKD1 and PKD2 in 700 unrelated patients.Hum Mutat,2012,33(8):1239-1250.

17 Rossetti S,Burton S,Strmecki L,et al.The position of the polycystic kidney disease 1 (PKD1) gene mutation correlates with the severity of renal disease.J Am Soc Nephrol,2002,13(5):1230-1237.

18 黃建鋒,肖華勝.目標(biāo)序列捕獲技術(shù)及其應(yīng)用.生物產(chǎn)業(yè)技術(shù),2011,(4):64-69.

19 Kotsis F,Boehlke C,Kuehn EW.The ciliary flow sensor and polycystic kidney disease.Nephrol Dial Transplant,2013,28(3):518-526.