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        L-鼠李糖的制備及檢測方法研究進(jìn)展

        2014-03-21 00:53:43高旭東郝寶成梁劍平陳士恩
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年18期
        關(guān)鍵詞:鼠李糖單糖色譜法

        高旭東,郝寶成,梁劍平*,陳士恩

        (1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730050;2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730030)

        甘露糖六位的一個羥基被氫取代而衍生的一種單糖,稱為L-鼠李糖(Rhamnose),又稱鼠李糖、甲基戊糖,L-鼠李糖的純品為無色粉末,呈結(jié)晶狀,自然界里主要存在于植物多糖、糖苷、植物膠及細(xì)菌多糖中,多為L型。其甜度是蔗糖的33%,可用于生產(chǎn)香精香料,可食用;可以作為藥物的中間體、合成強(qiáng)心藥物;可與其他物質(zhì)反應(yīng)形成風(fēng)味物質(zhì)、用作甜味劑;可用于農(nóng)作物疾病的防治;還可作為腸道滲透測試劑使用,并具有明顯的抗癌作用[1-3]。

        L-鼠李糖可以在植物中提取,也可以用發(fā)酵法等途徑進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)。目前,國內(nèi)外提取、分離和制備L-鼠李糖的技術(shù)工藝水平日趨提高,筆者就近年來L-鼠李糖的制備方法和檢測方法等幾方面概述L-鼠李糖的研究進(jìn)展。

        1 L-鼠李糖的制備方法

        1.1 植物中L-鼠李糖的提取 在自然界中,由于L-鼠李糖多存在于植物和細(xì)菌中,故可利用植物資源提取L-鼠李糖。肖芳等在穿龍薯蕷皂甙酸解液中提取L-鼠李糖所選方法為醇提取聯(lián)合高壓酸解法[4]。具體操作為:取新鮮穿龍薯蕷100 g,研磨并過篩后離心15 min,加醇提取所得離心沉淀2次,合并提取液,水浴蒸餾,溶劑回收,剩余餾渣即皂甙粗提物;60℃干燥至恒重后,于0.14 MPa下將其加適量酸水解一定時間,過濾;濾液添加Ca(OH)2中和至中性或偏酸性,脫色并過濾,添加酵母培養(yǎng)數(shù)小時,跟蹤測定葡萄糖至耗盡,發(fā)酵終止;過濾除去酵母及部分雜質(zhì),測定濾液的L-鼠李糖含量,計算L-鼠李糖得率;濾液濃縮后用乙醇重結(jié)晶,得L-鼠李糖晶體,最終L-鼠李糖得率最高為0.196%。

        劉叔興等以盾葉薯蕷(黃姜)為原料,從皂苷酸解液中提取出L-鼠李糖[5]。粉碎干黃姜,研磨后過篩,精密稱取10 g,萃取劑選用體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇,與適量的十二烷基硫酸鈉混合均勻。試驗(yàn)條件:黃姜和乙醇的質(zhì)量比是1∶10,25.8 kHz為超聲波頻率,超聲40 min,對總皂苷進(jìn)行提取,抽濾后濃縮濾液,加入濃度為1.5 mol/L的硫酸20 ml,于電熱套內(nèi)水解4 h,完畢后抽濾,濾渣沖洗至中性后烘干,可于索氏提取器內(nèi)提取制備皂苷元,濾液即為酸解液,向酸解液中加入Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH至中性或者偏酸性,過濾除去CaSO4沉淀,于濾液中加入活性炭進(jìn)行脫色,過濾除去色素,得到無明顯顏色的濾液。然后加入2% 的活化酵母,36℃恒溫發(fā)酵,用薄層色譜法跟蹤測定葡萄糖,待其耗盡即可終止發(fā)酵,過濾除去雜質(zhì),將濾液進(jìn)行L-鼠李糖含量測定并計算得率。濾液濃縮后用甲醇重結(jié)晶,可得L-鼠李糖晶體,最終L-鼠李糖得率最高為1.5%。

        以黃姜為原料,楊謙等研究了L-鼠李糖的提取工藝[6]。黃姜,也被稱為盾葉薯蕷,內(nèi)含薯蕷皂甙元的成甙糖類包含1個葡萄糖和2個L-鼠李糖,故可用于提取L-鼠李糖。優(yōu)化試驗(yàn)后,以50 g/L稀硫酸溶液為水解液水解2 h后,加入酵母菌發(fā)酵2 h(pH為6),得出L-鼠李糖提取率為1.5%。

        雖然植物是提取L-鼠李糖的重要來源,但由于其復(fù)雜的分離工藝以及高濃度的多糖限制了發(fā)酵中氧和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞,故該方法有一定的局限性。

        1.2 生物酶解法制備L-鼠李糖 L-鼠李糖多從天然植物中獲得,如從橡樹皮中提取櫟皮酮,通過水解得到含L-鼠李糖的溶液,經(jīng)分離提純獲得L-鼠李糖純品。此類生產(chǎn)方法有一定缺點(diǎn),如勞動強(qiáng)度大,分離提純過程中易生成有毒物質(zhì),原材料受季節(jié)、地域及運(yùn)輸?shù)纫蛩赜绊懀?]。

        作為方法改進(jìn),張美超等利用微生物所產(chǎn)的蘆丁α-L-鼠李糖苷酶酶解制備L-鼠李糖[1]。試驗(yàn)前期已篩選出一種蘆丁α-L-鼠李糖苷酶,該酶能特異性水解蘆丁上的L-鼠李糖苷鍵,生成異槲皮苷和L-鼠李糖[8]。取蘆丁24.0 g酶解,產(chǎn)物用大孔吸附樹脂分離,得L-鼠李糖粗糖液4.18 g,產(chǎn)率為17.4%。基于結(jié)晶法對L-鼠李糖粗糖液精制,在L-鼠李糖水溶液質(zhì)量濃度0.4 g/ml時,溶液達(dá)到過飽和狀態(tài)并開始結(jié)晶,得無色透明結(jié)晶,產(chǎn)率為27.5%。經(jīng)高效液相色譜檢測,L-鼠李糖純度高達(dá)99.0%。研究可為生物轉(zhuǎn)化法大量生產(chǎn)L-鼠李糖提供研究依據(jù),生物酶法因其具有水解特異性好、環(huán)境友好等特點(diǎn),為L-鼠李糖的制備提供了新的思路。

        1.3 微生物發(fā)酵制備L-鼠李糖 利用微生物生產(chǎn)含有L-鼠李糖的L-鼠李糖脂是大規(guī)模生產(chǎn)L-鼠李糖較有發(fā)展前景的方法。發(fā)酵法生產(chǎn)L-鼠李糖較常選用假單孢菌,其中銅綠假單孢菌[9]最為常用。培養(yǎng)的碳源、氮源、無機(jī)離子種類及濃度變化,均會影響L-鼠李糖脂的生物合成,有些碳源適于糖脂的形成。在微生物發(fā)酵法制備L-鼠李糖的條件對比研究中,李祖義等選取糠油為碳源,利用假單胞菌發(fā)酵制備L-鼠李糖脂,水解后分離得L-鼠李糖[7]。

        也可利用再生材料制備L-鼠李糖脂,水解后得L-鼠李糖。雖然生產(chǎn)L-鼠李糖脂的原料一直來源很廣,從石油化學(xué)衍生的物質(zhì)到天然原料,最常用的是植物油、糖和甘油?,F(xiàn)已證明,許多廢棄物也可能用于生產(chǎn)L-鼠李糖脂,如脂肪酸、廢煎炸油、橄欖油的生產(chǎn)廢水、乳清廢物[10]??偨Y(jié)了“傳統(tǒng)的”生產(chǎn)L-鼠李糖脂的可再生原料:糖、油、甘油及潛在的可利用廢棄物??偨Y(jié)了對下一代產(chǎn)L-鼠李糖脂菌種的要求,如下:擴(kuò)大原料譜,增加代謝譜,減少副產(chǎn)物的形成和更易于控制。如果能達(dá)到這點(diǎn),L-鼠李糖脂的規(guī)?;a(chǎn)在經(jīng)濟(jì)上是可行的,并且在不遠(yuǎn)的將來,可能在商業(yè)水平上獲得成功。

        L-鼠李糖可由L-鼠李糖脂水解制備。堿法水解可用1 mol/L NaOH 40℃ 回流12 h,酸法水解可用1 mol/L HCl回流2.5 h,或者在30~100℃ 加H2SO4水解。L-鼠李糖脂水解后得到L-鼠李糖和3-羥基酸,可用乙酸乙酯萃取3-羥基酸,L-鼠李糖在水層;也可用離子交換法,調(diào)pH>5,用陰離子柱分離3-羥基酸;還可用層析法分離L-鼠李糖[11]。

        經(jīng)大量實(shí)踐后,工業(yè)化生產(chǎn)選用發(fā)酵法為L-鼠李糖的主要制備方法。生產(chǎn)的L-鼠李糖依據(jù)中間產(chǎn)物的不同可分為2類:一類為由微生物或藻類生產(chǎn)含L-鼠李糖基的多糖,水解獲得L-鼠李糖;另一類為利用微生物生產(chǎn)L-鼠李糖脂,水解L-鼠李糖脂得到L-鼠李糖。然而,該法在制備L-鼠李糖過程中明顯存在不足:L-鼠李糖在多糖中含量往往偏低,水解后含有其他單糖,為后期分離提取增加難度和成本;發(fā)酵液中時?;煊须s蛋白,為多糖的分離提純增加困難;多糖易受本身性質(zhì)影響,如用發(fā)酵液黏度過高,工藝條件不易操控等[9]。

        因此,利用微生物生產(chǎn)L-鼠李糖脂后經(jīng)水解制備L-鼠李糖是大規(guī)模生產(chǎn)L-鼠李糖較有發(fā)展前景的方法。

        2 L-鼠李糖的檢測方法

        L-鼠李糖是單糖,故其含量檢測方法可參照其他單糖的測定方法。單糖通常用二硝基水楊酸法(DNS法)[12-13]、高效液相色譜法[14-16]、毛細(xì)管柱氣相色譜法[17-18]和薄層色譜法[19-21]等方法進(jìn)行含量測定。

        2.1 二硝基水楊酸法(DNS法) 二硝基水楊酸法是依據(jù)二硝基水楊酸在堿性條件下與還原糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成產(chǎn)物在煮沸條件下實(shí)現(xiàn)棕紅色,再用比色法測定還原糖含量的一種檢測方法。因?yàn)樘穷愑坞x出還原基團(tuán)的數(shù)量可決定其顯色的深淺,并對還原糖的種類無選擇性,故DNS法廣泛應(yīng)用于多糖等水解后生產(chǎn)多種還原糖體系中。

        選取盾葉薯蕷為原料,劉樹興等研究了從皂苷酸解液中提取L-鼠李糖的工藝[4]。在提取出L-鼠李糖后,采用DNS法進(jìn)行L-鼠李糖含量的測定,并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出回歸方程,利用得率公式:得率(%)=L-鼠李糖質(zhì)量/盾葉薯蕷原料質(zhì)量×100%進(jìn)行含量計算。測定結(jié)果為,盾葉薯蕷總還原糖的得率為2.19%,L-鼠李糖得率為1.5%。

        張美超等采用DNS測糖法測定L-鼠李糖含量[1],試驗(yàn)配制 1 mg/ml的 L-鼠李糖溶液 25 ml,分別取 1、2、3、4、5 ml于5支刻度管中,分別用去離子水定容至10 ml,以制備L-鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液??v坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)糖濃度,橫坐標(biāo)為光密度OD540nm,繪制準(zhǔn)曲線。DNS法測得粗糖液含有L-鼠李糖4.18 g,得率為17.4%。

        2.2 高效液相色譜法 高效液相色譜法(HPLC)是色譜法的一個重要分支,選取液體為流動相,利用高壓輸液系統(tǒng),將不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱,各組分在柱內(nèi)分離后進(jìn)入檢測器檢測,以實(shí)現(xiàn)試樣的分析。該法在化工、醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)及商品檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域中起到重要作用。

        高效液相色譜法在單糖及多糖檢測中起到重要作用。在《國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊》[22]中曾刊登出《HPLC法定量測定尿中L-鼠李糖、甘露醇及乳果糖評估小腸通透性在兒科的應(yīng)用》一文,文中介紹作者采用了示差高壓液相色譜法(HPLC法),以乳果糖為大分子探針糖,甘露醇和L-鼠李糖為小分子探針糖,研究14名健康兒童在14 d內(nèi)無胃腸道癥狀,禁食一夜后收集試驗(yàn)前尿樣。隨后,每人口服100 ml含5 g乳果糖、l g L-鼠李糖和1 g甘露醇的溶液,收集5 h內(nèi)的尿樣,記錄總體積,取20 ml尿液置-20℃凍存至分析。試驗(yàn)以HPLC柱為氨基修飾的硅膠柱,流動相為乙睛∶水(70∶30,V/V),流速為 1 ml/min,LC 1240 折射率示差檢測。結(jié)果得出L-鼠李糖保留時間為6.2 min,最低檢出濃度為0.1 mmol/L。

        楊俊等選取Waters高效糖分析柱,利用梯度洗脫分離,建立了同時測定煙草中水溶性糖的新方法——高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD)[23]。試驗(yàn)條件:流動相為乙腈-水,流速1.0 ml/min,柱溫30℃,進(jìn)樣量為20 μl;蒸發(fā)光散射檢測器漂移管的溫度為80℃,載氣選擇氮?dú)?,流速?.00 L/min。稱取0.45~0.30 mm粒徑的煙草樣品1.0 g,準(zhǔn)確至0.000 1 g,加入25 ml的超純水,超聲波輔助浸提40 min,溫度40℃,過濾后量取5 ml溶液,流速為1.0 ml/min通過已活化的反相C18固相萃取柱,將最初2 ml溶液棄去,收集后面3 ml溶液,再經(jīng)0.45 μm的水系濾膜過濾。經(jīng)HPLC分析得出L-鼠李糖線性范圍為0.5~30.0 μg,煙草及其制品中包括低含量L-鼠李糖等糖類物質(zhì)的分析與質(zhì)量控制可用該法測定。

        2.3 薄層色譜法 薄層色譜法(TLC)又稱薄層層析法,是對少量物質(zhì)進(jìn)行快速分離、定性分析的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。是在玻璃板、塑料或鋁基片上涂抹一層薄厚均勻的固定相,點(diǎn)樣后展開,將比移值(Rf)與適宜的對照物的比移值(Rf)比較,進(jìn)行藥物鑒定、檢查雜質(zhì)或測定含量。

        據(jù)報道,采用薄層層析法對黃姜中的L-鼠李糖進(jìn)行提取并定性分析[1]。劉叔興等從皂苷酸解液中提取L-鼠李糖時,也采用此法進(jìn)行定性分析[5]。薄層色譜條件為:展開劑為V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(醋酸)∶V(水)=60∶15∶15∶10;顯色劑為10%硫酸乙醇溶液;Rf值為0.76,斑點(diǎn)為圓形且無拖尾;噴濕潤后于100℃烘烤10 min,得到L-鼠李糖斑點(diǎn),與標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)一致。

        2.4 其他檢測方法 由于L-鼠李糖屬于單糖、水溶性還原糖,因此可參考其他類似糖類的檢測方法。目前國內(nèi)對食品中糖含量的檢測多采用化學(xué)檢測法、高效液相色譜-熒光檢測法、離子色譜法、毛細(xì)管柱氣相色譜法、流動注射分光度法[24]等。

        3 結(jié)論

        綜上所述,化學(xué)法與其他方法相比較為耗時,且只能測定總糖或還原糖的含量,無法進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析;高效液相色譜-示差折光法的靈敏度較低;離子色譜法在糖類含量測定中較為常見,靈敏度較好,但糖類在電極表面易發(fā)生氧化還原反應(yīng),影響方法準(zhǔn)確度。因此,對于L-鼠李糖中檢測要求定性分析,選用薄層色譜法即可。對于在L-鼠李糖檢測中要求檢測靈敏度高,準(zhǔn)確度好應(yīng)該首選高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法,該方法也被廣泛應(yīng)用于其他糖類的定性定量檢測中。

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