王雪花，程明霄，朱　倩，趙天琦

(1．南京工業(yè)大學(xué)自動化與電氣工程學(xué)院，江蘇南京　210009；2．南京灼徽檢測技術(shù)有限公司，江蘇南京　210009)

0　引言

拉曼光譜作為一種無損檢測鑒定方法和手段，越來越受到重視和普及。尤其是顯微拉曼技術(shù)的發(fā)展，拓寬了拉曼光譜儀在微區(qū)分析方面的應(yīng)用。這種分析方法主要是將顯微鏡與拉曼光譜結(jié)合使用。國內(nèi)顯微拉曼技術(shù)尚處于起步階段，拉曼儀器基本依賴進(jìn)口[1]。國內(nèi)若干院校和中科院開始研制用于教學(xué)和實(shí)驗(yàn)室的拉曼光譜儀，如浙江大學(xué)開發(fā)的LRZ-1型拉曼光譜儀，用于監(jiān)測蒸餾、分離等生產(chǎn)過程控制中的中間產(chǎn)物[2]。國內(nèi)的科研人員在顯微拉曼光譜的應(yīng)用方面也做了不少研究。祖恩東、王昆林等探討了顯微拉曼光譜用于翡翠鑒定的可行性，并且對翡翠掛件中是否含有石蠟等高分子填充物進(jìn)行了鑒定[3-4]。低成本、小型化、性能優(yōu)越、用于樣品無損分析的顯微拉曼光譜儀的研究和設(shè)計(jì)很有必要。

1　顯微拉曼光譜技術(shù)的分析基礎(chǔ)

拉曼散射是指當(dāng)光照射在介質(zhì)上，除被介質(zhì)反射、吸收和透射及瑞利散射外，還有一部分與入射光波長不同的散射光，稱之為拉曼散射光。拉曼光譜分析中的特征量是拉曼頻移和散射強(qiáng)度。

拉曼頻移是拉曼散射光相對于入射光頻率的變化量，是非彈性散射最主要的特征量，可以作為拉曼檢測中分子結(jié)構(gòu)定性分析的理論基礎(chǔ)。頻率變化增加或減小用波數(shù)差來表示，獲取的拉曼光譜譜圖的橫坐標(biāo)一般就是波數(shù)(wave number)，其單位為cm-1．同一種物質(zhì)分子，隨著入射光頻率的改變，拉曼線的頻率也隨之改變，但拉曼頻移始終保持不變，因此拉曼頻移與入射光頻率無關(guān)，而僅與物質(zhì)分子的振動和轉(zhuǎn)動能級有關(guān)。物質(zhì)分子不同，其振動和轉(zhuǎn)動能級也不同的，因而其拉曼頻移不同的[5]。

拉曼光譜的強(qiáng)度I與散射中心(包括基團(tuán)和化學(xué)鍵)的數(shù)目成正比，因此，譜線強(qiáng)度的變化即代表著散射中心(包括基團(tuán)和化學(xué)鍵)數(shù)目的變化。譜峰值大小則說明該頻段上對應(yīng)的某種基團(tuán)和化學(xué)鍵數(shù)量多少。在入射光的強(qiáng)度保持恒定的條件下拉曼散射信號強(qiáng)度與待測物質(zhì)濃度成正比，這正是拉曼光譜法進(jìn)行定量分析的基礎(chǔ)。

2　激光顯微拉曼光譜儀的部分設(shè)計(jì)

2．1顯微鏡系統(tǒng)與光路設(shè)計(jì)

2．1．1顯微物鏡的選擇

顯微物鏡是光學(xué)顯微鏡最重要的組成部分，它負(fù)責(zé)形成原始圖像，并發(fā)揮核心作用。常用的物鏡有3種：一種是消色差物鏡，可以校正兩種色光產(chǎn)生的色差；另一種是復(fù)消色差物鏡，其性能遠(yuǎn)優(yōu)于普通消色差物鏡，它能夠校正3種顏色的光線產(chǎn)生的色差；還有一種是平場物鏡，它能夠校正場曲，使整個像面為一個平面[6]。該設(shè)計(jì)對顯微鏡的圖像并不追求很高的光強(qiáng)，但為了看清樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，對圖像清晰度有一定的要求，因此選擇帶有常規(guī)平場消色差物鏡的顯微鏡。

2．1．2光學(xué)系統(tǒng)的選擇

適用于顯微拉曼光譜系統(tǒng)的顯微鏡必須為無限遠(yuǎn)光場顯微鏡，與有限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)相比，無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)中有一段由成像透鏡和物鏡構(gòu)成的平行光線空間，這也正是無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)使用越來越普遍的原因。這段平行光束理論上可以無限延長，因此，根據(jù)設(shè)計(jì)需要，可以在其中加入各種光學(xué)附件，這些光學(xué)附件包括偏振光分離器、濾色鏡等。由于成像光束在平行光束之后，因此在平行光束中添加光學(xué)附件不會影響成像質(zhì)量，簡化了物鏡的設(shè)計(jì)[7]。

如圖1所示，在無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)中，在物鏡與成像透鏡之間加入其他光學(xué)附件，成像點(diǎn)的位置不變，而有限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)中，若是增減其他光學(xué)附件，會造成成像點(diǎn)的偏移。由此可見，只能選擇具有無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)的顯微鏡進(jìn)行切換設(shè)計(jì)，才能保證目鏡和攝像頭處的精確成像，而有限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)適用于各個元件固定不變的情況。

圖1無限遠(yuǎn)光學(xué)校正系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)示意圖

該光源切換裝置正是根據(jù)無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)的原理，作為附加光學(xué)器件設(shè)計(jì)安裝在物鏡與成像透鏡之間，只用來改變光的方向，不影響成像點(diǎn)的質(zhì)量。

2．1．3顯微鏡的切換光路設(shè)計(jì)

基于以上對顯微鏡無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)和顯微物鏡選擇的要求，設(shè)計(jì)了顯微鏡與外光路的切換光路。

設(shè)計(jì)采用的是一維空間濾波光路，因此對顯微鏡的光路設(shè)計(jì)并不困難，第一步是在顯微照明光路的末端，增設(shè)一面反射率高達(dá)99．5%的全反鏡和拉桿裝置。全反鏡以45°角放置在光路中，拉桿裝置實(shí)現(xiàn)激發(fā)光源(激光)和照明光源(鹵素?zé)艄?的切換。由于光路的可逆性，樣品被激發(fā)后產(chǎn)生的拉曼信號經(jīng)物鏡和鏡筒后成為平行光，沿原路返回。設(shè)計(jì)結(jié)果如圖2所示。

圖2　激光的引入與導(dǎo)出

2．2外光路系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

由于散射光與單根光纖耦合效率很低，采用多根收集光纖可以提高散射光與光纖的耦合效率，從而增加拉曼散射信號的收集效率。所以采用多光纖探頭的設(shè)計(jì)方案，外光路設(shè)計(jì)示意圖如圖3所示。

圖3　外光路設(shè)計(jì)圖

設(shè)計(jì)的外光路系統(tǒng)主要包括：激發(fā)光纖、收集光纖束、準(zhǔn)直透鏡、前置全息濾光片、反射鏡、后置全息濾光片、聚焦透鏡。激發(fā)光纖用于將激光器發(fā)出的激光引入外光路。用準(zhǔn)直透鏡準(zhǔn)直激發(fā)光纖射出的激光，使之變?yōu)槠叫泄?。其中前置全息濾光片用于濾除激光器在產(chǎn)生激光過程中產(chǎn)生的其他波長的激光和譜線，使激光變得純凈，避免其他譜線對拉曼信號的干擾。反射鏡用于反射激發(fā)激光使之射向顯微鏡。后置全息濾光片用于濾除散射信號中的瑞利散射，并使拉曼散射信號通過。聚焦透鏡則把拉曼散射信號聚焦，然后用光纖接頭SMA905將拉曼散射信號耦合至收集光纖束，導(dǎo)入光譜儀，完成對拉曼光譜儀顯微系統(tǒng)和外光路部分的設(shè)計(jì)。

3　光譜儀的標(biāo)定

3．1光譜儀部分

該光譜儀由光柵分光系統(tǒng)和CCD檢測單元組成。但在初步設(shè)計(jì)后，直接測得的是光譜強(qiáng)度與CCD像元數(shù)的拉曼譜圖，而實(shí)際中用的最多的是光譜強(qiáng)度I與波數(shù)(wave number)之間的拉曼譜圖，因此，將CCD采集得到的原始拉曼譜圖存在計(jì)算機(jī)中，并設(shè)定一種標(biāo)定方法，這樣，系統(tǒng)每次都會對CCD采集的拉曼譜圖進(jìn)行相應(yīng)的系統(tǒng)校正。

3．2CCD標(biāo)定方法與結(jié)果

目前，CCD標(biāo)定最常用的方法有原子吸收譜法、標(biāo)準(zhǔn)光源法、濾光片法等，使用最廣泛的方法是利用標(biāo)準(zhǔn)光源如由汞、氬、氫的單元素構(gòu)成的氣體發(fā)出的特定波長的譜線與其在CCD上成像像元的對應(yīng)關(guān)系進(jìn)行曲線擬合。但是特征譜線的數(shù)目和范圍會一定程度上影響標(biāo)定的精度。

雖然光譜儀的標(biāo)定最常用的方式是采用標(biāo)準(zhǔn)光源的特征譜線對CCD檢測器進(jìn)行標(biāo)定，但這種方法一般是針對全光譜標(biāo)定有效，而這次采用的光柵為細(xì)分光柵，在同一屏上無法顯示所有波長對應(yīng)的譜線，因此，標(biāo)準(zhǔn)光源標(biāo)定法無效。所以考慮采用標(biāo)準(zhǔn)譜圖擬合法，由于對測量結(jié)果的精度有一定的要求，因此不能簡單的認(rèn)為波數(shù)與像元成線性關(guān)系，必須對其進(jìn)行系數(shù)校正，具體描述如下。

圖4所示的甲苯標(biāo)準(zhǔn)光譜為CAS化學(xué)藥品數(shù)據(jù)庫提供，橫坐標(biāo)表示拉曼頻移I(k)，縱坐標(biāo)表示拉曼強(qiáng)度I(p)。圖5為采用研制的顯微拉曼光譜儀對甲苯進(jìn)行10次測量取平均值得到拉曼光譜，橫坐標(biāo)表示CCD的像元數(shù)p，縱坐標(biāo)表示拉曼強(qiáng)度l(q)。從圖4中可以看出，甲苯共有6條強(qiáng)度十分明顯的峰，波數(shù)分別為3 055 cm-1、1 211 cm-1、1 031 cm-1、1 005 cm-1、787 cm-1和522 cm-1，采用1 024×256像素的CCD檢測器，有效波長范圍為300～1 100 nm，所以3 055 cm-1波數(shù)不在光譜儀CCD檢測器相應(yīng)范圍內(nèi)，因此選用前5條波數(shù)來進(jìn)行定標(biāo)。

表1列出甲苯五條特征峰與其對應(yīng)的像元數(shù)。圖4中5條特征峰的中心位置分別為522 cm-1、787 cm-1、1 005 cm-1、1 031 cm-1和1 211 cm-1，記為k(i)。圖5中5條特征峰的中心位置對應(yīng)的像元數(shù)是246、448、619、641和786，記為p(i)，k和p之間的轉(zhuǎn)換關(guān)系可用式(1)來表示。

k=a0+a1x+a2x2+…+anxn

(1)

圖4　甲苯的標(biāo)準(zhǔn)拉曼光譜

圖5　標(biāo)定前甲苯的拉曼光譜

表1　5條特征譜線與其對應(yīng)的像元數(shù)

采用最小二乘法的多項(xiàng)式曲線擬合法則進(jìn)行標(biāo)定，觀察不同的擬合次數(shù)的擬合效果，擬合得到的波數(shù)越接近標(biāo)準(zhǔn)波數(shù)，則說明此時的擬合次數(shù)最為適宜，分別取n=1、2、3時，得到波數(shù)k與像元數(shù)p之間的函數(shù)關(guān)系如下：

線性擬合：

k=211.218 79+1.277 34x

2)

二次擬合：

k=188.068 52+1.383 37x-1.044 73×10-4x2

(3)

三次擬合：

k=184.180 6+1.410 55x-1.605 88×10-4x2+3.561 48×10-8x3

(4)

三次擬合曲線如圖6所示，三種擬合對應(yīng)的擬合結(jié)果見表2，殘差分布圖見圖7。

圖6　三次擬合結(jié)果

表2　甲苯的擬合結(jié)果　cm-1

圖7　線性擬合殘差圖

從圖7的殘差分布圖可知，三次擬合的殘差最小，說明了它比另外兩種擬合方式的定位更為準(zhǔn)確。因此，采取三次擬合來進(jìn)行光譜儀的標(biāo)定。在完成對光譜儀的標(biāo)定之后，借助計(jì)算機(jī)就可以把I(p)-p形式的光譜圖轉(zhuǎn)換為I(k)-k形式的光譜圖，圖8是標(biāo)定之后甲苯的拉曼光譜。

4　結(jié)束語

通過對激光顯微拉曼光譜儀的顯微結(jié)構(gòu)、

圖8　標(biāo)定后甲苯拉曼光譜

光路結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造和設(shè)計(jì)，完成了器件的選型和顯微鏡的改裝，已達(dá)到預(yù)期的設(shè)計(jì)；最后選擇了合適的光譜儀標(biāo)定方法，即采用標(biāo)準(zhǔn)譜圖擬合法，經(jīng)過驗(yàn)證，確定了三次多項(xiàng)式擬合為最佳擬合結(jié)果，得到了較好的甲苯拉曼光譜圖，擬合結(jié)果基本相同。由于該設(shè)計(jì)的激光顯微拉曼光譜儀目前仍采用單一功率的激光，不可調(diào)節(jié)，以后可以根據(jù)需要在激發(fā)激光光路中增設(shè)線性漸變密度濾光片(LVND)，以步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動，形成激光強(qiáng)度的自動控制，從而使儀器的使用不受樣品熱穩(wěn)定性的制約。

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