韓曉雪 呂玲玲 羅曉霞 張利莉

(塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點實驗室, 新疆 阿拉爾 843300)

羅布泊位于新疆塔里木盆地東部，曾是我國第二大內(nèi)陸湖，現(xiàn)已干涸。羅布泊地區(qū)常年干旱，日照強(qiáng)度強(qiáng)，晝夜溫差大，夏季氣溫高達(dá)71 ℃，為一望無際的戈壁灘，被視為“生命禁區(qū)[1]”。2012年，關(guān)統(tǒng)偉對羅布泊地區(qū)土壤放線菌非培養(yǎng)和可培養(yǎng)多樣性進(jìn)行了研究?？膳囵B(yǎng)發(fā)現(xiàn)18個屬的放線菌，其中放線多孢菌屬(Actinopolyspora)是羅布泊鹽湖中純培養(yǎng)的優(yōu)勢類群，并且發(fā)現(xiàn)8個新物種；非培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖霉菌屬(Glycomyces)為羅布泊地區(qū)優(yōu)勢菌群，打破了人們對環(huán)境中鏈霉菌為放線菌優(yōu)勢菌群的常規(guī)認(rèn)識[2]。

Glycomyces為糖霉菌科(Glycomycetaceae)典型屬，1997年由Stackebrandt等人根據(jù)16S rRNA序列相似性提出[3]，是糖霉菌科中最大的一個屬，包括11個有效發(fā)表的種，Glycomycesharbinensis作為該科的模式種[4]。Glycomyces放線菌均分離自植物或土壤，除Glycomyceshalotolerans分離自極端特殊環(huán)境，可耐受10%鹽濃度外，其余種都分離自普通環(huán)境[4-10]。迄今為止，羅布泊Glycomyces多樣性的研究鮮有報道。本研究以新疆羅布泊地區(qū)土壤樣品為材料，使用5種培養(yǎng)基，共分離到7株Glycomyces放線菌，將分離得到的Glycomyces放線菌菌株通過16S rDNA測序，利用系統(tǒng)發(fā)育分析，以期揭示羅布泊土壤Glycomyces放線菌的多樣性，為開發(fā)利用這一類微生物資源提供理論基礎(chǔ)和菌種支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源及處理

2010年從新疆羅布泊采集土壤樣品。樣品采集后裝于無菌的自封袋中，運(yùn)抵實驗室后保存在-20℃冰箱中。

土壤樣品自然風(fēng)干，稱取2 g土壤樣品放入18 mL的無菌15. 06% NaCl溶液中，加入無菌玻璃珠，37℃充分振蕩1 h，制成10-1懸濁液。

表1 羅布泊土壤樣品理化性質(zhì)鑒定結(jié)果

1.1.2 主要儀器和試劑

PCR儀:德國SensoQuest Labcycler；凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAD；高速離心機(jī)：德國Eppendorf。

PCR擴(kuò)增全套試劑購自廣州東盛生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶HaeIII，連接試劑盒pMD18-T購自TaKaRa。其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：(1)甘油精氨酸培養(yǎng)基(G-J)[12](2)甘露醇酸水解酪蛋白培養(yǎng)基(GW1)[13](3)高氏一號培養(yǎng)基(GSA) (4)淀粉酸水解酪蛋白培養(yǎng)基(SCK)[14](5)甘油天冬氨酸培養(yǎng)基(C1)[15]。

1.3 菌株的分離與純化

利用上述培養(yǎng)基，分別設(shè)置1. 5%、5%、10%、15%和20%五個鹽濃度梯度，采用稀釋平板涂布法進(jìn)行分離。培養(yǎng)基加入重鉻酸鉀以抑制細(xì)菌和霉菌的生長。37℃恒溫培養(yǎng)3周，再挑取分離培養(yǎng)平板上放線菌形態(tài)不同的單菌落轉(zhuǎn)接到相應(yīng)鹽濃度的純化培養(yǎng)基ISP-4上。

1.4 DNA的提取、菌株鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育分析

采用SDS-CTAB法提取菌株DNA[16]，選取細(xì)菌16S rRNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3′)，1492R(5′-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序。測序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中通過BLAST 程序進(jìn)行相似性比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。用MEGA 5.1 Bate2 軟件進(jìn)行多序列比對，并采用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 抗菌活性

牛津杯法又稱管蝶法[17-18]。以金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，大腸桿菌和白色念珠菌為靶標(biāo)菌(表2)。以Glycomyces放線菌發(fā)酵液為原料，篩選菌株抗菌活性。

表2 靶標(biāo)菌信息

2 結(jié)果

2.1 羅布泊地區(qū)Glycomyces放線菌物種多樣性

通過稀釋平板涂布法對羅布泊土壤放線菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，經(jīng)過測序和序列比對，共分離到7株Glycomyces的放線菌菌落形態(tài)見圖1，菌絲形態(tài)見圖2。菌株TRM 49570和TRM 45406與Glycomyceshalotolerans TRM 40137T相似性為99. 07%和100%，其余5株TRM 49117、TRM 49136、TRM 45387、TRM 45127和TRM 45198與其親緣關(guān)系最近菌株的相似性在94. 00～96. 58%之間(表3)，可能為Glycomyces的潛在新分類單元。

圖1 羅布泊Glycomyces放線菌單菌落形態(tài)

圖2 羅布泊Glycomyces放線菌菌絲形態(tài)(100×)

表3 羅布泊Glycomyces放線菌16S rRNA序列相似性比對結(jié)果

由圖1和2可以看出，羅布泊地區(qū)Glycomyces放線菌形態(tài)多樣，菌落圓形，TRM 45198菌落為肉芋色，其余均為白色，TRM 45127和TRM 45198菌落表面光滑，呈珍珠狀，TRM 45406和TRM 49570菌落表面呈絨毛狀，TRM 49117，TRM 45387和TRM 40137菌落表面有明顯的褶皺，除TRM 45127和TRM 45198都可產(chǎn)生白色的氣生菌絲，TRM 49117還可產(chǎn)生深褐色的可溶性色素。在光學(xué)顯微鏡下可見細(xì)長、彎曲的菌絲，分枝明顯。其中，TRM 45387、TRM 45127和TRM 49117菌絲分枝較多。

2.2 羅布泊地區(qū)Glycomyces放線菌系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

將7株Glycomyces放線菌測序后，通過GenBank 數(shù)據(jù)庫由BLAST 程序進(jìn)行相似性比對，下載鄰近菌株序列，用MEGA 5.1 Bate2 軟件在Glycomycetaceae內(nèi)進(jìn)行多重序列比對，采用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。

圖3 羅布泊地區(qū)Glycomyces菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖3可見，菌株TRM 49117、TRM 49136 、TRM 45387、TRM 45127和TRM 45198以極高的自展值在Glycomycetaceae科內(nèi)形成穩(wěn)定的、獨(dú)立的分支，根據(jù)比對結(jié)果和進(jìn)化距離分析，它們同最近親緣關(guān)系的G.halotoleransTRM 40137T和G.arizonensisNRRL B-16153T的相似性僅為94. 00%、94. 93% 、96. 58%、94. 67%和94. 41%代表Glycomyces內(nèi)的新種。

菌株TRM 45127和TRM 45198間的相似性為99%，可能為同一個種的不同菌株；TRM 45127和TRM 45198與TRM 49136的相似性均為98%，可能為相同種，但是根據(jù)菌株的菌落形態(tài)(圖1 e、f、g)和顯微形態(tài)(圖2 e、f、g)特征差異，可以初步推斷TRM 45127和TRM 45198與TRM 49136為不同種，還需進(jìn)一步驗證。菌株之間的相似性見表4。

表4 羅布泊Glycomyces菌株間相似性比較

續(xù)表4 羅布泊Glycomyces菌株間相似性比較

2.3 抗菌活性

7株Glycomyces放線菌發(fā)酵液經(jīng)過抗菌活性檢測，結(jié)果見圖4。

圖4 菌株TRM 45387對E. coli 7-5抑菌活性(慶大霉素 5μg/mL)

由以上結(jié)果可以看出，僅TRM 45387對E. coli 7-5表現(xiàn)出抑制作用，抑菌圈大小為22±1 mm，其余6株均未對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、表皮球菌、大腸桿菌表現(xiàn)出抑制活性。

3 討論

本研究表明羅布泊地區(qū)Glycomyces放線菌在營養(yǎng)需求上與普通環(huán)境的Glycomyces放線菌表現(xiàn)出明顯差異，這種差異主要表現(xiàn)在分離培養(yǎng)基的營養(yǎng)配比上。從已有研究來看，Glycomyces放線菌除G.halotolerans分離自極端特殊環(huán)境土壤外，其余種類都分離自植物和土壤等普通環(huán)境，比較這些Glycomyces放線菌的分離培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，主要含有酵母提取物[4-10]，酵母提取物的主要成分為多肽、氨基酸、核苷酸、B族維生素及微量元素，被認(rèn)為是最為理想的生物培養(yǎng)基原料。而酵母提取物用于羅布泊貧瘠土壤則分離不到任何Glycomyces放線菌。土樣理化性質(zhì)檢測表明，羅布泊地區(qū)屬于典型的鹽堿環(huán)境，與已報道分離出Glycomyces的其它環(huán)境有較大區(qū)別，土壤總鹽含量為15. 06%，陽離子主要為Na+，其次為K+，陰離子則以Cl-為主，土壤有機(jī)質(zhì)含量極低，營養(yǎng)極為匱乏。這些原因可能導(dǎo)致了羅布泊地區(qū)Glycomyces在種類上明顯不同于其它普通環(huán)境。

本研究分離到的7株Glycomyces放線菌中70%以上的菌株與已發(fā)表菌株序列的相似性低于97%，且親緣關(guān)系最近的G.halotoleransTRM 40137T也分離自羅布泊。從系統(tǒng)進(jìn)化樹中也可以看出，除TRM 45387外，羅布泊地區(qū)的Glycomyces放線菌形成一個相對獨(dú)立的大分支。從已完成的TRM 49117和TRM 49136的多相分類工作來看，比較它們與Glycomyces其它成員的差異發(fā)現(xiàn)，羅布泊地區(qū)Glycomyces可耐受較高的鹽濃度，可在高于10%的培養(yǎng)基中生長；細(xì)胞化學(xué)組成也不同于Glycomyces其他成員，如TRM 49117和TRM 49136的極性脂類型較Glycomyces其他成員更豐富。根據(jù)表型、化學(xué)型及基因型的特征，因此可以確定菌株TRM 49117和TRM 49136是Glycomyces的新分類單元。這些羅布泊地區(qū)Glycomyces放線菌的獨(dú)特性可能是在羅布泊獨(dú)特的地理位置和高溫干旱的氣候環(huán)境中長期適應(yīng)進(jìn)化而形成的。地理位置和氣候環(huán)境可能是導(dǎo)致它們差異的根本原因，這些種類是否存在真正意義上的生物地理分布，尚有待進(jìn)一步研究。

自抗生素被發(fā)現(xiàn)以來，三分之二以上都是由放線菌產(chǎn)生的。當(dāng)普通環(huán)境發(fā)現(xiàn)新活性代謝產(chǎn)物的可能性逐漸降低時，人們將目光投向了極端特殊環(huán)境和海洋環(huán)境。目前，已從土壤[5]、藥用植物[9]、海洋[10]和海洋沉積物[19]等環(huán)境中分離到Glycomyces的放線菌。而羅布泊高溫干旱、高鹽堿的環(huán)境蘊(yùn)藏著大量Glycomyces放線菌的未知新資源，這些新物種的發(fā)現(xiàn)必定將伴隨著新的代謝產(chǎn)物及活性物質(zhì)的產(chǎn)生。自1985年Labeda等人建立Glycomyces以來的20多年中，僅 Labeda等人(1987)報道了來源于菌株G.harbinensisATCC 43155T能產(chǎn)生無定形的氨基酸類物質(zhì)，具有抗菌和抗腫瘤活性，對革蘭氏陰性菌、陽性菌、小鼠淋巴細(xì)胞性白血病 P388、人類肺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞等有抑制作用[20]。近年來，隨著研究技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來越多具有抗菌活性的Glycomyces放線菌被報道。Adeline Su Yien Ting等人(2009)從土壤和植物根際土壤中分離到2株Glycomyces放線菌，它們對金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和綠膿桿菌都有很好的抑制作用[21]；袁麗杰等人(2012)從藥用植物蒿本的根際土壤中分離到一株Glycomyces放線菌I06-02658，其發(fā)酵液具有Caspase7 抑制活性[22]。通常放線菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物多數(shù)都對革蘭氏陽性菌有明顯的抑制作用，對革蘭氏陰性菌的抑菌率相對較低，而本研究中TRM 45387僅對大腸桿菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性。有研究表明氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類或四環(huán)素類抗生素對革蘭氏陰性菌有很好的抑制作用的同時，對革蘭氏陽性菌也有抑菌活性[23]。由此看來TRM 45387可能具有產(chǎn)生只抑制革蘭氏陰性菌的“特異性”新化合物的能力，而羅布泊來源的Glycomyces是否具有其它生物活性尚不得而知。因此可以認(rèn)為，Glycomyces作為一類較為“年輕”的物種具有較高的研究價值，值得深入研究。

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