(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

棉花黃萎病是由半知菌亞門(mén)輪枝菌屬真菌-大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb)引起的一種土傳維管束真菌性病害，其直接影響產(chǎn)棉區(qū)棉花的產(chǎn)量和質(zhì)量，成為制約棉產(chǎn)區(qū)棉花高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的主要因素[1]。然而，目前針對(duì)棉花黃萎病防治沒(méi)有很有效的藥劑。近些年來(lái)，隨著有機(jī)農(nóng)業(yè)和綠色農(nóng)業(yè)興起，利用生物防治棉花黃萎病已經(jīng)備受人們關(guān)注[2]。細(xì)菌因其繁殖速度快、抗逆能力強(qiáng)、易定殖在植物表面，營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、并且對(duì)多種病原真菌、細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑制作用，具有廣譜抗菌性，成為越來(lái)越受矚目的生防研究材料之一[3]，如研究較多的細(xì)菌有芽孢桿菌屬、小單孢菌屬、哈夫尼菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬和巨大芽孢桿菌等[4-5]，但是引入的生防菌很難在新疆棉田或棉株中定植，這限制生防菌在新疆棉田中的推廣與應(yīng)用，從新疆棉田中分離適應(yīng)當(dāng)?shù)孛尢锏纳谰且环N必然趨勢(shì)。拮抗細(xì)菌TUBP1菌株是本課題組從南疆連作15年棉花根部土壤中分離的拮抗細(xì)菌，該菌株發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎菌具有較強(qiáng)的抑制作用，提示此菌可能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，在棉花黃萎病防治方面具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值和前景。本研究在單因素研究基礎(chǔ)上擬采用Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法(RSE)對(duì)影響棉花黃萎病拮抗菌TUBP1的發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源、碳源及無(wú)機(jī)鹽因素進(jìn)行考察和評(píng)價(jià)，并對(duì)這三個(gè)主要因素配方進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方，旨在為進(jìn)一步棉花黃萎病拮抗菌TUBP1批量發(fā)酵和小試生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

棉花黃萎病原菌：大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaKleb ATCC36211)。

拮抗菌細(xì)菌TUBP1：由塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，分離于新疆農(nóng)一師12團(tuán)棉田土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基配方[7]

NB培養(yǎng)基：20 g葡萄糖，10 g蛋白胨，5 g NaCl，5 g牛肉膏，1 000 mL水PDA培養(yǎng)基：20 g葡萄糖，20 g瓊脂，200 g馬鈴薯，1000 mL水發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖1%，蛋白胨1%，NaCl 0.1%，KH2PO40. 2%， pH7. 5。

1.2 方法

1.2.1 TUBP1種子液的制備

拮抗菌TUBP1種子液的制備：將配好的NB培養(yǎng)基分裝于250 mL三角瓶中，每瓶裝60 mL，121 ℃滅菌30 min后，每瓶接種1 mL拮抗菌TUBP1，37 ℃、180 rpm min-1條件下，搖瓶培養(yǎng)24 h后，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 發(fā)酵液制備及預(yù)處理

發(fā)酵液的制備：在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以每50 mL溶液加入1 mL的拮抗菌TUBP1種子液，37 ℃、180 rpm min-1條件下，搖瓶培養(yǎng)48 h后，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將發(fā)酵液以8 000 rpm min-1的速度離心10 min 去除發(fā)酵液中的菌絲體等固體，取上清液，用微孔濾膜(0. 22 μm)抽濾除去上清液中懸浮的雜菌和細(xì)小雜質(zhì)，分裝，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定

將棉花黃萎病菌接種PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)9天，用直徑為9 mm的打孔器取邊緣菌塊作為菌餅，備用。

將無(wú)菌PDA培養(yǎng)基于微波爐中加熱使溫度降至 45 ℃時(shí)，無(wú)菌操作下，100 mL PDA培養(yǎng)基中加入20 mL無(wú)菌發(fā)酵液，搖勻后倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，待其鋪平凝固，冷卻后，在含有發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基中央接入病原菌菌餅。25 ℃培養(yǎng)，用游標(biāo)卡尺每隔2 d計(jì)量菌絲生長(zhǎng)直徑，以不加發(fā)酵組為對(duì)照組。每個(gè)處理重復(fù)3次。

菌落直徑(cm)=測(cè)量菌落直徑平均值-0. 9抑制菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對(duì)照組菌落直徑×100

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的篩選

碳源的篩選：選取碳源蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉，分別設(shè)其濃度梯度為1%、2%、3%，代替發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源。在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以每50 mL溶液加入1 mL的拮抗菌TUBP1種子液，37 ℃、180 rpm min-1條件下，搖瓶培養(yǎng)48 h后，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ缓髮l(fā)酵液以8 000 rpm min-1，離心10 min，去除發(fā)酵液中的菌絲體等固體，取上清液，用微孔濾膜(0. 22 μm)抽濾除去上清液中懸浮的雜菌和細(xì)小雜質(zhì)，分裝，備用。發(fā)酵液抗菌活性參照1.2.3，計(jì)算抑制率，比較拮抗細(xì)菌TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基中不同碳源對(duì)棉花黃萎病的抑制率，篩選出最佳碳源。

氮源的篩選：選取氮源酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏，分別1%、2%、3%三個(gè)濃度梯度，并替換發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源。在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以每50 mL溶液加入1 mL的拮抗菌TUBP1種子液，37 ℃、180 rpm min-1條件下，搖瓶培養(yǎng)48 h后，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ缓髮l(fā)酵液以8 000 rpm min-1的速度離心10 min 去除發(fā)酵液中的菌絲體等固體，取上清液，用微孔濾膜(0. 22 μm)抽濾除去上清液中懸浮的雜菌和細(xì)小雜質(zhì)，分裝，備用。發(fā)酵液抗菌活性參照1.2.3，計(jì)算抑制率，比較拮抗細(xì)菌TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基中不同氮源對(duì)棉花黃萎病的抑制率，篩選出最佳氮源。

無(wú)機(jī)鹽的篩選：選MnCL2、FeSO4、CuSO4分別設(shè)0. 1%、0. 3%、0. 5%三個(gè)濃度加入發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以每50 mL溶液加入1 mL的拮抗菌TUBP1種子液，37 ℃、180 rpm min-1條件下，搖瓶培養(yǎng)48 h后，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。然后將發(fā)酵液以8 000 rpm min-1的速度離心10 min 去除發(fā)酵液中的菌絲體等固體，取上清液，用微孔濾膜(0. 22 μm)抽濾除去上清液中懸浮的雜菌和細(xì)小雜質(zhì)，分裝，備用。發(fā)酵液抗菌活性參照1.2.3，計(jì)算抑制率，比較拮抗細(xì)菌TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基中不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)棉花黃萎病的抑制率，篩選出最佳無(wú)機(jī)鹽。

1.2.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面優(yōu)化

采用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert.V8.06，按照Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。以抑制率為響應(yīng)值(Y)，碳源(X1)氮源(X2)和無(wú)機(jī)鹽(X3)分別為自變量，其中碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽由1.2.4篩選獲得。發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)的因素、水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1

表1 TUBP1 菌株發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源的篩選

圖1 碳源對(duì)棉花黃萎病拮抗菌TUBP1發(fā)酵液抑菌活性影響

由圖1可知，棉花黃萎病菌拮抗細(xì)菌TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基中不同碳源(淀粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖)對(duì)棉花黃萎病菌抗菌活性的影響。拮抗細(xì)菌TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基中淀粉含量為1%、2%、3%時(shí)，對(duì)棉花黃萎病菌抑制率分別為25. 9%、42. 75%、14. 5%；拮抗細(xì)菌TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖含量為上述三個(gè)濃度梯度時(shí)，對(duì)棉花黃萎病菌抑制率分別為21%、21. 4%、16%；拮抗細(xì)菌TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基中麥芽糖含量為1 %，2 %，3 % 時(shí)，抑制率分別為37 %，36. 7%，32. 8%；拮抗細(xì)菌TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖含量在上述濃度梯度時(shí)，抗菌活性抑制率分別為40. 5%，43%，39%；由以上數(shù)據(jù)可得，棉花黃萎病菌拮抗細(xì)菌TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖時(shí)，發(fā)酵液抗菌活性最好；其中葡萄糖濃度為2% 時(shí)，發(fā)酵液抑制率最高為43%。

2.2 氮源的篩選

圖2 氮源對(duì)棉花黃萎病拮抗菌TUBP1發(fā)酵液抑菌活性影響

由圖2可知，棉花黃萎病菌拮抗細(xì)菌TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基中不同氮源(蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白)對(duì)棉花黃萎病菌抗菌活性的影響。拮抗細(xì)菌TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源含量為1%、2%、3%時(shí)，其中氮源為蛋白胨，拮抗菌TUBP1發(fā)酵液抗菌活性抑制率分別為45. 8%、42. 4%、47. 9%；其中氮源為牛肉膏，拮抗菌TUBP1發(fā)酵液抗菌活性抑制率分別為45. 4%，46. 8%，44. 3%；氮源為胰蛋白，拮抗菌發(fā)酵液抗菌活性抑制率分別為：41. 8%，38. 2%，40. 1%；由以上數(shù)據(jù)可得3%蛋白胨的抑制率最高為47. 9%。

2.3 無(wú)機(jī)鹽的篩選

圖3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)棉花黃萎病拮抗菌TUBP1發(fā)酵液抑菌活性影響

由圖3可知，棉花黃萎病菌拮抗細(xì)菌TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基中不同無(wú)機(jī)鹽(硫酸銅、硫酸亞鐵、氯化錳)對(duì)棉花黃萎病菌抗菌活性的影響。在無(wú)機(jī)鹽濃度為0. 1%、0. 3%、0. 5% 時(shí)，硫酸銅的抑制率分別為32. 7%，35. 6%，35. 2%；硫酸亞鐵的抑制率分別為29. 1%，28. 6%，35%；氯化錳的抑制率分別為：47%，26. 7%，40. 2%。由以上數(shù)據(jù)可知，拮抗細(xì)菌TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽為氯化錳的抑制率較好；且濃度為0. 1%時(shí)，抑制率最高為47%。

2.4 響應(yīng)面分析的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果表

利用Design Expert.V8.06軟件，對(duì)Box-Benhnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得拮抗菌TUBP1發(fā)酵抗菌活性對(duì)葡萄糖、蛋白胨和無(wú)機(jī)鹽的多元二次回歸方程: Y=52. 16-1. 408 75A+0. 866 25B-3. 225C+0. 317 5AB-0. 05AC+0. 5BC-2. 396 25A2-2. 196 25B2-3. 013 75C2式中：Y為抑菌活性單位，A為葡萄糖，B為蛋白胨，C為無(wú)機(jī)鹽。

2.4.2 響應(yīng)面圖分析

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y(抑制率)對(duì)應(yīng)與實(shí)驗(yàn)因素X1、X2和X3(X1為碳源，X2為氮源，X3為無(wú)機(jī)鹽)所構(gòu)成的三維空間的曲面圖及其在二維平面上的等高線(xiàn)圖，其可以直觀的反映各因素及它們之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4-6。

圖4 蛋白胨和葡萄糖對(duì)TUBP1菌株抑菌活性影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖

圖5 無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖對(duì)TUBP1菌株抑菌活性影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖

圖6 無(wú)機(jī)鹽和蛋白胨對(duì)TUBP1菌株抑菌活性影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖

由圖4可知，隨著拮抗菌TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白胨和葡萄糖濃度的增大，TUBP1菌株發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病菌抑菌率先快速提高后緩慢降低，由此可見(jiàn)，適當(dāng)?shù)脑龃蟀l(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白胨和葡萄糖含量，可以一定程度提高菌株抑菌率。從圖5可以看出，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽與葡萄糖提高，菌株抑菌率也表現(xiàn)為先增大后降低。從圖6中，發(fā)酵培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽及蛋白胨對(duì)拮抗菌TUBP1發(fā)酵液抑菌率的影響與圖5相似，因此，在實(shí)際操作中，應(yīng)慎重控制葡萄糖、蛋白胨及無(wú)機(jī)鹽，以獲得較高的抑制率。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)所得模型，利用Design Expert.V8.06軟件對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，在模型取值范圍內(nèi)選擇最低點(diǎn)為起始點(diǎn)，由模型使用快速上升法進(jìn)行優(yōu)化，可預(yù)測(cè)在穩(wěn)定狀態(tài)下的最優(yōu)工藝條件為葡萄糖2. 58%、蛋白胨2. 96%、MnCl20. 048%。在此條件下TUBP1菌株的抑菌率理論上可達(dá)53. 3%。為了驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果是否與真實(shí)情況相一致，根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了近似驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，做了6組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。

表4 最佳工藝條件驗(yàn)證結(jié)果

由表4可以看出，在最佳工藝條件下，拮抗細(xì)菌TUBP1菌株發(fā)酵液的抑菌率平均值實(shí)可達(dá)53. 63%，與預(yù)測(cè)值接近，與理論值偏差小于5%，且重復(fù)性也很好，因此進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 結(jié)論與討論

隨著綠色農(nóng)業(yè)的興起，棉花黃萎病菌的生物防治是棉花病害防治的研究熱點(diǎn)。這源于微生物農(nóng)藥具有環(huán)境友好、高效、低毒、殘留少等特點(diǎn)。拮抗微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物是其主要抗菌方式之一，通過(guò)對(duì)其天然抗菌活性物質(zhì)的篩選，為開(kāi)發(fā)新的農(nóng)用藥物研究奠定基礎(chǔ)。本課題組從新疆棉花連作棉田土壤中分離一株棉花黃萎病菌拮抗菌株TUBP1，對(duì)其發(fā)酵液中活性成分分析，有望開(kāi)發(fā)成新型農(nóng)用抗生素。為了獲得TUBP1發(fā)酵液中高活性抗棉花黃萎病菌活性成分，對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化是必要條件。

本文通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)篩選出TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，并首次采用Box—Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法，優(yōu)化拮抗菌TUBP發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的最佳配比，獲得了發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化模型：Y=52. 16-1. 408 75A+0. 866 25B-3. 225C+0. 317 5AB -0. 05AC+0. 5BC-2. 39625A2-2. 19625B2-3. 01375C2，通過(guò)搖瓶驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值擬合良好。

通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化模型得到拮抗菌TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖2. 58%；蛋白胨2. 96%；MnCl20. 048%時(shí)，發(fā)酵液抗菌活性最好，抑制率為53. 63%。

響應(yīng)面分析法(RSM)是一種在多因素系統(tǒng)中尋找最優(yōu)工藝參數(shù)的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，它包括多種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Plackett-Burma、Box-Behnken、Central composite design等)、建模、因子效應(yīng)評(píng)估以及尋求因子最佳操作條件，該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于各種微生物培養(yǎng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中[8]，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)果。

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