劉加勇，王思敏，林婷婷，馮浩，寧宏

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，沈陽(yáng)110001）

GRIM-19在H2O2誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的表達(dá)

劉加勇，王思敏，林婷婷，馮浩，寧宏

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，沈陽(yáng)110001）

目的觀察干擾素/維甲酸聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因19（GRIM-19）在不同濃度H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞（HLEC）氧化應(yīng)激中的表達(dá)變化。方法免疫熒光法檢測(cè)GRIM-19在正常HLEC中的表達(dá)及定位；建立HLEC氧化損傷模型：分別用濃度為0、20、100、300、400和800 μmol/L的H2O2處理HLEC 1 h后換液，繼續(xù)孵育6、24 h；MTT法檢測(cè)各濃度H2O2對(duì)HLEC的生長(zhǎng)抑制作用；Western blot法檢測(cè)6 h組HLEC中GRIM-19表達(dá)的變化。結(jié)果免疫熒光結(jié)果示：GRIM-19主要表達(dá)于HLEC細(xì)胞質(zhì)中；MTT結(jié)果示：100～800 μmol/L H2O2對(duì)HLEC有增殖抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01），20 μmol/L組與空白對(duì)照組未見明顯差異（P＞0.04）；Western blot結(jié)果顯示：GRIM-19在各濃度組中相對(duì)表達(dá)量分別為1.466±0.018，1.409±0.038，1.499±0.014，1.709±0.048，1.813±0.010，1.483±0.021，實(shí)驗(yàn)組均顯著高于空白對(duì)照組，正常對(duì)照組與空白對(duì)照組未見明顯差異（P＜0.04）。結(jié)論正常HLEC中存在GRIM-19表達(dá)。在一定濃度H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中，GRIM-19的表達(dá)顯著增加。

GRIM-19；H2O2；人晶狀體上皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激

白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展與晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷有關(guān)［1］。氧化損傷是導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要因素之一。研究表明，晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡是除先天性白內(nèi)障以外所有類型白內(nèi)障的共同細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)［2］。多種調(diào)控基因參與了晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。干擾素/維甲酸聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因（genes associated with retinoid interferon induced mortality，GRIM）19是最近發(fā)現(xiàn)的一組參與干擾素和維甲酸合并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因群，它不僅具有啟動(dòng)凋亡的作用，還參與細(xì)胞線粒體的呼吸鏈功能。

房水和晶狀體可產(chǎn)生和降解H2O2，正常人晶狀體和房水的H2O2濃度為20～30 μmol/L，白內(nèi)障患者房水中的H2O2濃度約為10～660 μmol/L［3］。本研究采用不同濃度的H2O2處理人晶狀體上皮細(xì)胞（human lens epithelial cell，HLEC），模擬晶狀體氧化損傷過程［4］，通過檢測(cè)GRIM-19基因和蛋白的表達(dá)情況，揭示GRIM-19與氧化損傷引起的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

HLEC細(xì)胞株：HLECs系SRA01/04（北京中國(guó)科學(xué)院腫瘤研究所）；胰蛋白酶、DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；MTT（美國(guó)Sigma公司）；鼠抗人GRIM-19（Abcam公司）；HRP標(biāo)記二抗（山羊抗鼠；博士德公司）；小鼠抗人GAPDH（ABMART公司），H2O2（美國(guó)Sigma公司）

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：采用含100 ml/L胎牛血清的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液，于37℃、4%CO2、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞傳代，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至亞匯合狀態(tài)時(shí)，換無血清培養(yǎng)液靜止24 h；用H2O2終濃度分別為0、20、100、300、400、800 μmol/L的培養(yǎng)液處理細(xì)胞1 h后換無血清培養(yǎng)液，分別孵育6 h及24 h。H2O2濃度0 μmol/L組為空白對(duì)照組，20 μmol/L組為正常對(duì)照組，100～800 μmol/L組為實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 免疫熒光法檢測(cè)GRIM-19在正常HLEC中的表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HLEC，胰酶消化后接種于24孔板（取中間2孔），每孔400 μL細(xì)胞懸液（約含2 000個(gè)細(xì)胞）。貼壁培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，PBS搖床洗滌3次，每次4 min；4%多聚甲醛固定30 min，PBS搖床洗滌3次；0.2%tritonX-100，37℃透膜30 min，PBS搖床洗滌3次；4%BSA，37℃封閉抗原30 min；去掉BSA加入1∶100滴度的一抗，4℃過夜；第2天置于搖床上搖勻10 min，37℃復(fù)溫60 min，PBS搖床洗滌3次；加入封閉液和1∶200滴度的二抗，避光，搖床搖勻4 min，37℃孵育60 min；加入DAPI，室溫下20 min染核；照相。

1.2.3 MTT比色法檢測(cè)H2O2對(duì)HLEC的氧化損傷：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HLEC經(jīng)胰酶消化后，接種于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液（含4 000個(gè)細(xì)胞）。貼壁培養(yǎng)24 h后，棄原液，按上述實(shí)驗(yàn)分組要求處理各組6 h、24 h。同時(shí)設(shè)立凋零孔（加培養(yǎng)液），各實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及調(diào)零組設(shè)4個(gè)平行孔。各組處理完畢后，每孔加MTT（4 μmol/L）20 μL，再培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液。每孔加DMSO 140 μL，避光振蕩混勻，結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)490 nm的吸光度值（OD值），每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算生長(zhǎng)抑制率（IR）=（1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值）×100%。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)GRIM-19蛋白的表達(dá)：取6 h各組。待各組作用完畢，冰上加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞。14 000 r/min、4℃離心14 min去除細(xì)胞碎片后，取含30 μL蛋白的細(xì)胞裂解液行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜。4%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜。TBST洗滌液（10 mmol/L Tris-HCl pH7.14，140 mmol/L NaCl，1%Tween -20）洗膜3次，每次14 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗，室溫?fù)u動(dòng)2 h，洗膜3次，每次14 min。ECL發(fā)光3 min，曝光膠片；用UV I凝膠成像分析系統(tǒng)（UV I soft UV I band window sapplication V97.04）測(cè)量條帶的光密度，GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白和內(nèi)參蛋白二者光密度的比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。利用ImageJ圖像分析系統(tǒng)測(cè)定內(nèi)參蛋白GAPDH與GRIM-19條帶的灰度值，兩者比值作為GRIM-19蛋白的相對(duì)表達(dá)量。所有數(shù)據(jù)以表示。MTT和Western blot結(jié)果的總體比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.04為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示：GRIM-19在HLEC中有表達(dá)，且主要定位于細(xì)胞質(zhì)（紅色熒光為GRIM-19相應(yīng)抗體的標(biāo)記熒光；藍(lán)色熒光為細(xì)胞核染料DAPI熒光），見圖1。

2.2 H2O2對(duì)HLEC的生長(zhǎng)抑制作用

不同濃度的H2O2作用HLEC 1 h后，分別換液孵育6 h后，OD值分別為0.418±0.024，0.424±0.010，0.346±0.029，0.204±0.026，0.164±0.014，0.147±0.009（F=146.708，P＜0.04）；孵育24 h后，OD值分別為0.368±0.007，0.369±0.089，0.234±0.008，0.174± 0.011，0.144±0.089，0.130±0.070（F=623.849，P＜0.04）。隨著濃度的增高，H2O2對(duì)HLEC生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈濃度依賴性。當(dāng)藥物濃度達(dá)800 μmol/L時(shí)，6 h和24 h細(xì)胞增殖抑制率達(dá)62.44%和64.67%，IC40均在100～300 μmol/L之間。各濃度組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.04）。見表1，圖2。

2.3 GRIM-19表達(dá)結(jié)果分析

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：GRIM-19相對(duì)表達(dá)量分別為1.466±0.018，1.409±0.038，1.499±0.014，1.709±0.048，1.813±0.010，1.483±0.021，表達(dá)水平與對(duì)照組相比均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 43.732，P＜0.04）。見圖3。

圖1 GRIM-19在HLEC中的表達(dá)和定位（免疫熒光檢測(cè)結(jié)果）Fig.1 The expression and position of GRIM-19 displayed by immuneofluorescence

表1 H2O2對(duì)HLEC增殖的影響Tab.1 The effect of H2O2in human lens epithelial cells

圖2 不同濃度H2O2對(duì)HLEC的生長(zhǎng)抑制作用Fig.2 Proliferation inhibition on HLEC caused by different concentration of H2O2

圖3 Western blot檢測(cè)不同濃度H2O2作用HLEC時(shí)GRIM-19蛋白水平表達(dá)變化Fig.3 Expression of GRIM-19 protein determined by Western blot in HLEC

3 討論

在體外培養(yǎng)的晶狀體中，活性氧自由基的出現(xiàn)導(dǎo)致晶狀體內(nèi)的水不溶性蛋白增加，從而發(fā)生白內(nèi)障［3］。H2O2是導(dǎo)致白內(nèi)障的主要氧化物。本研究結(jié)果顯示，20 μmol/L H2O2組與空白對(duì)照組比較細(xì)胞生長(zhǎng)未見明顯差異；100～800 μmol/L組對(duì)體外培養(yǎng)的HLEC有顯著的生長(zhǎng)抑制作用并呈劑量依賴關(guān)系。

GRIM-19是GRIMs家族成員之一，是Angell等［4］2000年通過反義敲出技術(shù)發(fā)現(xiàn)的新的細(xì)胞凋亡因子。GRIM-19是由144個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的分子量為16 kDa的小分子蛋白，定位于染色體19P13.2。Fearnley等［6］及Huang等［7］研究發(fā)現(xiàn)GRIM-19主要定位于線粒體，即使存在于細(xì)胞核中，也應(yīng)該是微量的。而在此前報(bào)道的GRIM-19在細(xì)胞核中表達(dá)的結(jié)果可能是由于抗體對(duì)核蛋白的非特異性反應(yīng)所致。當(dāng)然，也可能在某種刺激過程中，GRIM-19由線粒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。本研究通過免疫熒光檢測(cè)證實(shí)HLEC SRA01/04中存在GRIM-19的表達(dá)，且主要是位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖1），與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

GRIM-19的作用機(jī)制較為復(fù)雜，它不僅具有啟動(dòng)凋亡的作用，還參與細(xì)胞線粒體的呼吸鏈功能［8～11］。線粒體是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞器，參與細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，是細(xì)胞死亡的控制中心，在細(xì)胞死亡及凋亡過程中都起著樞紐作用。線粒體也是體內(nèi)氧自由基最主要的來源。高濃度的活性氧自由基極易氧化損傷線粒體內(nèi)膜、DNA等超微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致線粒體功能喪失，最終引起細(xì)胞壞死或凋亡。在正常情況下，生物體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和抗氧自由基損傷系統(tǒng)處于相對(duì)平衡的狀態(tài)；當(dāng)細(xì)胞遭受氧化損傷因素作用時(shí)，這種平衡狀態(tài)就會(huì)打破，進(jìn)而發(fā)生一系列改變，這些改變可以通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子及其表達(dá)的蛋白的改變表現(xiàn)出來。GRIM-19的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增加GRIM-19的表達(dá)則顯著增加細(xì)胞的死亡［12］。GRIM-19對(duì)于維持線粒體膜電位至關(guān)重要，Lu等［13］的研究認(rèn)為，GRIM-19的C-端區(qū)域?yàn)榫S持跨膜電位所必需，而完整的跨膜電位可以保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100、300、400和800 μmol/L H2O2處理組HLEC內(nèi)GRIM-19的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=44.607，P＜0.04）；20 μmol/L組與空白對(duì)照組相比未見明顯差異（P＞0.04）。H2O2濃度為20～400 μmol/L時(shí)，GRIM-19的蛋白表達(dá)量與H2O2濃度呈正相關(guān)，即GRIM-19表達(dá)量隨H2O2濃度的增加而增加。20 μmol/L組的作用與對(duì)照組相比無顯著差異（P＞0.04）。H2O2濃度由400 μmol/L升高到800 μmol/L時(shí)，GRIM-19蛋白相對(duì)表達(dá)量反而下降，這可能是由于濃度過高引起細(xì)胞壞死，目的蛋白被分解所致。上述結(jié)果表明HLEC中存在GRIM-19，且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中；H2O2導(dǎo)致的HLEC氧化損傷過程中，GRIM-19蛋白表達(dá)水平升高，且一定濃度范圍內(nèi)其表達(dá)量與HLEC死亡率呈正相關(guān)，提示GRIM-19參與了H2O2誘導(dǎo)的HLEC氧化損失過程。

綜上所述，本研究利用H2O2處理HLEC，模擬氧化應(yīng)激過程，并檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白GRIM-19的表達(dá)變化，證實(shí)了GRIM-19參與了HLEC氧化應(yīng)激損傷過程，為白內(nèi)障發(fā)生機(jī)制的研究提供了新的思路。本研究?jī)H對(duì)氧化應(yīng)激導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生的機(jī)制進(jìn)行了初步探討，有關(guān)GRIM-19的詳盡分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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（編輯 王又冬）

Research ofthe Expression ofControlling Genesof CellApoptosis GRIM-19 in Human Lens Epithelial Cells Induced by Hydrogen Peroxide

LIU Jia-yong，WANGSi-min，LINTing-ting，F(xiàn)ENGHao，NINGHong
（DepartmentofOphthalmology，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effects of hydrogen peroxide（H2O2）at various concentrations on the proliferation andGRIM-19expression of human lens epithelial cells（HLEC）.MethodsThe expression and position of GRIM-19 was detected by immunofluorescence.The oxidation stress models ofHLECwere established by differentdose ofH2O2（0，20，100，300，400，800μmol/L）on HLEC.The survivaland proliferation of the cells was quantified by MTT assay before treatment and at 6，24 hours after one hour treatment of H2O2.The concentration of GRIM-19 in the HLEC was measured by Western blot at 6 hours after the treatment of H2O2.The immunofluorescence results shows the expression of GRIM-19 in LEC.It mainly exists in cytoplasm.ResultsThe immunofluorescence showed the expression of GRIM-19 in LEC.It mainly existed in cytoplasm、Results ofMTT show thata certain concentration range ofH2O2has a proliferation inhibition on HLEC.There is a dose-response relationship between 100 and 800 μmol/L.Compared with the control，difference have statistical significance（F6h=146.708，P＜0.01；F24h=623.849，P＜0.01）.We did not see an obvious difference between the group of 20 μmol/L and the blank control（P＞0.04）.The relative expression quantity of GRIM-19 detected by Western blot under 0，20，100，300，400，800 μmol/L treatment separately，was 1.466±0.018，1.409±0.038，1.499±0.014，1.709±0.048，1.813±0.010，1.483±0.021，which were significantly higher than the control group，excepted the normal group（F=43.732，P＜0.04）.ConclusionIt was confirmed that the GRIM-19 expressed in HLEC.There was a significantly increase of GRIM-19 in HLEC under the oxidative stress of a certain concentration ofH2O2.

GRIM-19；hydrogen peroxide；lens epithelial cell；oxidative stress

R776

A

0248-4646（2014）04-0337-04

遼寧省自然科學(xué)基金（2013021029）

劉加勇（1987-），男，碩士研究生.

寧宏，E-mail：xiaoxiao1998@21cn.com

2013-12-26

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：