王翀，吳鵬飛，王明昊，劉濟源

（1.沈陽市第四人民醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110031；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110001）

細胞外信號調(diào)節(jié)激酶對神經(jīng)膠質(zhì)瘤環(huán)氧合酶2基因表達的影響

王翀1，吳鵬飛2，王明昊2，劉濟源2

（1.沈陽市第四人民醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110031；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110001）

目的探討細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）對神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中環(huán)氧合酶2（COX-2）基因表達的作用。方法60只大鼠被隨機分成對照組、膠質(zhì)瘤組和ERK抑制劑組，每組20只。采用注射C6膠質(zhì)瘤細胞的方法制作小鼠膠質(zhì)瘤模型。采用免疫組織化學(xué)和Western blot檢測膠質(zhì)瘤組織中COX-2蛋白表達水平的變化，并采用RT-PCR檢測膠質(zhì)瘤組織中COX-2mRNA表達水平的變化。結(jié)果免疫組織化學(xué)方法和Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，膠質(zhì)瘤組大鼠膠質(zhì)瘤COX-2表達水平顯著升高（P＜0.01）；而與膠質(zhì)瘤組比較，ERK抑制劑組大鼠膠質(zhì)瘤COX-2表達水平顯著降低（P＜0.01）。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，膠質(zhì)瘤組大鼠膠質(zhì)瘤COX-2mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）；而與膠質(zhì)瘤組比較，ERK抑制劑組大鼠膠質(zhì)瘤COX-2mRNA表達水平顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論ERK能夠上調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中COX-2基因的表達。

細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；環(huán)氧合酶2；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；大鼠

腦膠質(zhì)瘤為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展及惡性生物學(xué)特征與腫瘤細胞內(nèi)的異常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)，而且因為其臨床手術(shù)全切除困難、易復(fù)發(fā)的特性，嚴重危害人類的健康。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號傳導(dǎo)通路參與了細胞生長、發(fā)育、增殖和分化以及細胞間的功能同步和細胞惡性轉(zhuǎn)化等多種生理、病理過程。ERK可被各種生長因子等有絲分裂原激活，進入細胞核，促進某些特異基因的轉(zhuǎn)錄與激活，進而在細胞惡性轉(zhuǎn)化及演進中起著重要作用［1～3］。研究并利用ERK在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用，能更好地指導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療策略的制定。本研究通過阻斷ERK后檢測環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）表達的變化來探討ERK在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

COX-2單克隆抗體，購自美國Santa Cruz公司；二抗山羊抗兔多克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；MEK1/2抑制劑U0126，購自碧云天有限公司；免疫組化SP試劑盒和DAB試劑盒，購自邁新公司。

1.2 大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)和實驗動物分組

大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞購自上海研域生物科技有限公司，在含10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素及100 U/mL青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、濕度100%、4%CO2培養(yǎng)。

Wistar健康雄性大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。大鼠以10%水合氯醛（3.4 mL/kg）腹腔注射麻醉后，固定于大鼠腦立體定位儀上，取冠狀縫前1.0 mm、矢狀縫右側(cè)3.0 mm鉆骨孔。以微量注射器抽吸10 μL含有1×106個C6細胞的懸液，于骨孔處進針深達硬膜下4.4 mm，退針0.4 mm，注射時間為10 min，留針10 min，使細胞充分沉積于右側(cè)尾狀核區(qū)［4］。移植C6膠質(zhì)瘤細胞14 d后，隨機分為3組。膠質(zhì)瘤組：解剖顯微鏡下分離并結(jié)扎右側(cè)頸總、頸外動脈的近心端，經(jīng)右側(cè)頸總動脈遠心端泵入無菌生理鹽水10 μL，作用30 min。ERK抑制劑組：泵入10 μL DMSO稀釋的U0126溶液（400 μmol/L）。對照組不作任何處理。

1.3 免疫組化方法

麻醉各組大鼠，經(jīng)左心室用4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦后固定6 h，浸入20%～30%蔗糖溶液中浸泡脫水72 h。常規(guī)等級乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，作連續(xù)冠狀腦切片，切片厚6 μm。采用SP方法檢測COX-2的表達，按照試劑盒說明書操作，結(jié)果進行平均光密度值分析。

1.4 Western blot方法

麻醉各組大鼠后立即在冰上斷頭，開顱取腫瘤組織，加入裂解緩沖液，剪碎并勻漿，4℃、17 000 r/min離心14 min，取上清液。采用BCA方法測定蛋白濃度，計算蛋白上樣量。SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)印，4%脫脂奶粉封閉，4℃孵育過夜，一抗COX-2，βactin（1∶400）室溫搖床孵育2 h，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶4 000），室溫搖床孵育2 h，ECL（美國Santa Cruz公司）光化學(xué)法顯色，曝光，膠片經(jīng)透射掃描儀掃描獲得圖像，以凝膠圖像掃描分析軟件測定條帶的積分光密度值，計算COX-2與β-actin的比值。

1.5 RT-PCR方法檢測COX-2mRNA的表達

麻醉各組大鼠后立即在冰上斷頭，開顱取腫瘤組織，按RNAout說明書進行總mRNA提取，然后以逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進行PCR擴增。COX-2引物序列見表1。擴增產(chǎn)物進行1.4%瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描并進行圖像分析。

表1 引物設(shè)計及長度Tab.1 The designed primers and amplification length

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 COX-2蛋白表達

免疫組化結(jié)果（圖1）顯示，對照組腦組織可見少量COX-2蛋白陽性細胞，膠質(zhì)瘤組大鼠膠質(zhì)瘤部位COX-2蛋白陽性細胞數(shù)明顯增多，ERK抑制劑組大鼠膠質(zhì)瘤COX-2蛋白陽性細胞數(shù)介于對照組與膠質(zhì)瘤組之間。膠質(zhì)瘤組與對照組比較、ERK抑制劑組與膠質(zhì)瘤組比較，COX-2蛋白陽性表達平均光密度值的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

從Western blot結(jié)果（圖2）可以看出，對照組大鼠COX-2蛋白表達量較低，與對照組比較，膠質(zhì)瘤組大鼠COX-2蛋白表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。ERK抑制劑組COX-2蛋白表達水平介于對照組與膠質(zhì)瘤組之間，與膠質(zhì)瘤組比較，ERK抑制劑組COX-2蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

2.3COX-2mRNA的表達結(jié)果

對RT-PCR（圖3）結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組與對照組比較，COX-2mRNA表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而ERK抑制劑組與膠質(zhì)瘤組相比，COX-2mRNA表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

圖1 免疫組化方法檢測COX-2的表達×200Fig.1 The expression of COX-2 detected by immunohistochemistry×200

表2 各組大鼠COX-2蛋白和mRNA表達的平均光密度值Tab.2 The average optical density value of COX-2 protein and mRNA expressions in rats of each group

圖2 Western blot檢測COX-2的表達Fig.2 The expression of COX-2 determined by Western blot

圖3 RT-PCR方法檢測COX-2mRNA的表達Fig.3 The expression of COX-2mRNA analyzed by RT-PCR

3 討論

腦膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)間質(zhì)細胞，是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，占成人所有惡性腫瘤的2%，具有浸潤性生長、易復(fù)發(fā)、侵襲性強、血管豐富等惡性生物學(xué)特征。膠質(zhì)瘤的發(fā)病原因目前尚不清楚，但有證據(jù)表明膠質(zhì)瘤的形成與一定的內(nèi)環(huán)境改變和基因變異有關(guān)，是一個多因素、多步驟的多種癌基因失調(diào)及抑癌基因缺失導(dǎo)致的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)的協(xié)同積累過程［4］。近年來，一些與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的異常信號通路成為研究熱點［6］。

ERK信號通路是普遍存在于真核細胞的一條高度保守的細胞信號傳導(dǎo)通路，該信號傳導(dǎo)通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生及惡性進展密切相關(guān)。ERK受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑其級聯(lián)中一般包括Ras、Raf、MAPKK和p42/44 MAPK（ERK1/ERK2）。ERK有兩條主要激活途徑：（1）經(jīng)受體酪氨酸激酶途徑激活ERK：Ras活化Raf，Raf作為MAPKK將MEK磷酸化激活，進而使ERK磷酸化活化；（2）G蛋白耦聯(lián)受體途徑：配體與膜上G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合引起受體構(gòu)型改變，激活磷脂酶C，使磷脂酰胺醇4、4二磷酸水解生成三磷酸肌醇和二酰基甘油。二?；视图せ畹鞍准っ窩，通過Ras或不依賴Ras激活ERK［7］。研究發(fā)現(xiàn)，Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的異常激活幾乎見于所有膠質(zhì)瘤中，與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及其惡性生物學(xué)特性密切相關(guān)，抑制該信號通路可能成為干預(yù)膠質(zhì)瘤的有效措施［8～10］。

環(huán)氧化酶是由2種基因型即COX-1和COX-2組成的催化前列腺素合成的限速酶。其中COX-2在大多數(shù)組織正常生理條件下并不存在，僅在細胞受到刺激時迅速合成，催化花生四烯酸產(chǎn)生多種前列腺素類物質(zhì)，通過多種途徑參與包括炎癥、腫瘤等多種病理生理過程。

COX-2是花生四烯酸代謝、前列腺素和血栓素A2生物合成過程中重要的誘導(dǎo)性酶，在正常生理狀態(tài)下幾乎不表達或甚少表達，具有廣泛的生理功能，對炎性反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、炎性疼痛、血管生成及栓塞和骨代謝等都具有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、頭頸部腫瘤、膀胱癌、淋巴瘤等多種腫瘤組織中均可見COX-2過度表達［11～13］，可見COX-2過度表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。COX-2過度表達可抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞的過度增殖，使細胞增殖和凋亡之間的平衡失調(diào)，從而促進腫瘤惡性行為的發(fā)生。研究認為其可能機制有：（1）COX-2的催化產(chǎn)物前列腺素E2能增加凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，從而抑制腫瘤細胞的凋亡［14］；（2）促進Survivin基因產(chǎn)生凋亡抑制蛋白，從而抑制細胞凋亡，加速腫瘤細胞生長［14］；（3）降低神經(jīng)酰胺水平，神經(jīng)酰胺是眾所周知的死亡信號，因此神經(jīng)酰胺水平下降可促進腫瘤細胞死亡；（4）影響一氧化氮通路，COX-2催化產(chǎn)物前列腺素E2可通過減弱和抑制一氧化氮途徑抑制細胞凋亡。

研究表明，緩激肽能夠通過B2受體誘導(dǎo)COX-2mRNA和蛋白的表達介導(dǎo)炎性反應(yīng)，MAPK家族的p38MAPK和ERKl/2通過調(diào)節(jié)COX-2的表達調(diào)節(jié)炎癥信號從細胞膜到細胞核的傳遞［16］。本研究利用顯微注射C6膠質(zhì)瘤細胞制作大鼠腦膠質(zhì)瘤模型，檢測發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤組大鼠COX-2蛋白及mRNA表達顯著高于對照組，結(jié)果說明COX-2可能在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，但是ERK是否能夠通過COX-2的表達參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病理機制尚不清楚。

為了進一步研究ERK信號通路對COX-2的作用，我們通過泵入ERK抑制劑U0126阻斷ERK信號通路，進一步檢測COX-2的表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與膠質(zhì)瘤組相比，ERK抑制劑組大鼠膠質(zhì)瘤COX-2蛋白及mRNA表達水平顯著降低。結(jié)果提示，ERK很可能通過調(diào)節(jié)其下游蛋白COX-2參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病理機制。綜上所述，本研究結(jié)果有利于更好地指導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療策略的制定。

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（編輯 陳姜）

EffectofExtracellular Signal-regulated Kinase on Cyclooxygenase-2 Expression in Glioma

WANGChong1，WUPeng-fei2，WANGMing-hao2，LIUJi-yuan2
（1.Department of Neurosurgery，The Fourth People′s Hospital of Shenyang City，Shenyang 110031，China；2.Department of Neurosurgery，The First Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the effectofextracellularsignal-regulated kinase（ERK）on the expression ofcyclooxygenase-2（COX-2）in glioma.MethodsA total of 60 rats were randomly divided into control group，glioma group and ERK inhibitor group（n=20 each group）.The expression ofCOX-2 protein was detected by and Western blotand immunohistochemistry.The expression ofCOX-2mRNA was detected by RT-PCR.Re?sultsThe results of immunohistochemistry Western blot showed that the expression level of COX-2 in rats of glioma group was higher than control group（P＜0.01）.Compared with glioma group，the expression of COX-2 was significantly decreased in rats of ERK inhibitor group.The level ofCOX-2mRNA in rats of glioma group was higher than the control group（P＜0.01）.Compared with glioma group，the expression ofCOX-2mRNA in rats of ERK inhibitor group was significantly decreased detected by RT-PCR（P＜0.01）.ConclusionERK could up-regulate the expression ofCOX-2in glioma.

extracellular signal-regulated kinase；cyclooxygenase-2；glioma；rat

R730.264

A

0248-4646（2014）04-0333-04

遼寧省博士科研啟動基金（20131149）

王翀（1976-），男，副主任醫(yī)師，本科. E-mail：wangchong197644@126.com

2013-12-29

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