玄基澤，陳丹，時(shí)暢，溫志紅，王輝

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，遼寧大連116011；2.大連市第五人民醫(yī)院放射線科，遼寧大連116021；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，遼寧大連116011）

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和E-cadherin在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

玄基澤1，陳丹1，時(shí)暢1，溫志紅2，王輝3

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，遼寧大連116011；2.大連市第五人民醫(yī)院放射線科，遼寧大連116021；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，遼寧大連116011）

目的檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及E-cadherin在胃癌組織中的表達(dá)，探討其臨床意義。方法采用熒光定量實(shí)時(shí)PCR定量分析病灶細(xì)胞中VEGF及E-cadherinmRNA轉(zhuǎn)錄量，Western blot分析VEGF及E-cadherin蛋白表達(dá)量，并采用免疫組化方法分析表達(dá)陽(yáng)性率。結(jié)果胃癌組織和無(wú)癌胃黏膜組織中VEGF蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為78.6%（44/70）和14.3%（4/34），E-cadherin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為22.9%（16/70）和91.4%（32/34）。VEGFmRNA在胃癌組織中的表達(dá)量高于無(wú)癌胃黏膜組織（P＜0.01），E-cadherinmRNA則相反（P＜0.01），且二者的表達(dá)量與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、TNM分期有關(guān)（P＜0.04）。結(jié)論胃癌組織中VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)增加，E-cadherinmRNA和蛋白則減少；提示VEGF和E-cadherin的表達(dá)與胃癌的生物學(xué)行為有關(guān)，可能參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。

胃癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞侵襲；血管內(nèi)皮因子；E-cadherin

胃癌是消化系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的健康，其發(fā)病率和死亡率較高，4年生存率較低。胃癌早期無(wú)特異的癥狀，難以診斷。胃癌致死病因大多是由于胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，約半數(shù)以上的患者在確診時(shí)已經(jīng)為晚期，四分之三以上的患者治療后發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。由于黏附因子的降解和癌細(xì)胞的黏附是導(dǎo)致腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的主要原因［1，2］，因此本研究探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和E-cadherin在胃癌中的表達(dá)，評(píng)價(jià)VEGF和E-cadherin表達(dá)的檢測(cè)在診斷胃癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和評(píng)價(jià)預(yù)后中的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

胃癌組織標(biāo)本取材于2009-2013年于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行胃癌手術(shù)的70例患者，其中男43例，女17例，年齡27～80歲，平均（46.4±4.7）歲。所有患者均行D2胃癌根治術(shù)，并且在術(shù)前未進(jìn)行其他放化療和抗腫瘤治療。其中高、中分化腺癌24例，低分化腺癌44例。取上述標(biāo)本中距癌組織10 cm以上切緣，免疫組化證實(shí)組織無(wú)癌浸潤(rùn)的無(wú)癌胃黏膜組織34例作為對(duì)照組。所有標(biāo)本均經(jīng)過4%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片，并經(jīng)病理確診。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高速臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；310型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；蛋白電泳及電轉(zhuǎn)系統(tǒng)、680型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR，RT-PCR）檢測(cè)VEGF和E-cadherin的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)用Trizol總RNA抽提純化及RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。利用GenBank檢索及Primer 4.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。VEGF上游引物：4′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：4′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAG CA-3′，產(chǎn)物260 bp；E-cadherin上游引物：4′-TACAC TGCCCAGGAGCCAGA-3′，下游引物：4′-TGGCACC AGTGTCCGGATTA-3′，產(chǎn)物960 bp。退火溫度分別為43℃和48℃，反應(yīng)條件均為94℃下預(yù)變性4 min 30 s；94℃變性30 s；72℃延伸3 min，34個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖電泳鑒定，采集后應(yīng)用分析軟件對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行光密度分析，以目的條帶灰度值為指標(biāo)評(píng)價(jià)胃癌組織及無(wú)癌胃黏膜組織的VEGF或E-cadherin的表達(dá)量。

1.3.2 Western blot：收集胃癌細(xì)胞并提取總蛋白。電泳（12%SDS-PAGE凝膠）、轉(zhuǎn)?。?0 V，120 min），4%正常小牛血清封閉，抗VEGF（1：1 000）、抗E-cadherin（1：800）及抗β-actin（1：200），4℃孵育過夜，分別于各自對(duì)應(yīng)的二抗（1：2 400）室溫孵育2 h，加入ECL顯影劑，經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集，進(jìn)行灰度值測(cè)定。

1.3.3 免疫組化染色：采用SP試劑盒（美國(guó)Maxin公司）檢測(cè)。石蠟切片在二甲苯及不同濃度的乙醇中常規(guī)脫蠟水化，切片浸泡在枸緣酸鹽緩沖液中，置于水浴加熱后室溫冷卻，之后用PBS漂洗。在過氧化氫中孵育后用PBS漂洗，封閉血清室溫封閉后用PBS漂洗。滴加稀釋的一抗，4℃孵育過夜后用PBS漂洗；用生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育后用PBS漂洗；用HRP-Avdin室溫孵育后用PBS漂洗。用DAB顯色后鏡下觀察，待充分顯色后終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染后用乙醇脫水，再用中性樹脂封片。

1.4 結(jié)果判定

以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性的胃癌組織切片作陽(yáng)性對(duì)照。每張切片由2位不知曉患者臨床病理資料的病理醫(yī)師分別對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行判讀，依照Fromowitz綜合計(jì)分法，將陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與細(xì)胞著色強(qiáng)度綜合判定，陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為10個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比：＜4%計(jì)0分，4%～24%計(jì)1分，26%～40%計(jì)2分，41%～74%計(jì)3分，＞74%計(jì)4分；細(xì)胞著色強(qiáng)度：不著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。二者積分相加：0～2分為陰性，＞2分為陽(yáng)性，并計(jì)算陽(yáng)性百分率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示。胃癌組織與無(wú)癌胃黏膜組織間的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.04為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1VEGF和E-cadherinmRNA的表達(dá)

VEGFmRNA在胃癌組織（0.79±0.13）中的表達(dá)量高于無(wú)癌胃黏膜組織（0.39±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；E-cadherinmRNA的表達(dá)則呈相反趨勢(shì)，即在無(wú)癌胃黏膜組織（0.87±0.14）中的表達(dá)量高于胃癌組織（0.07±0.02）（P＜0.01）。見圖1。

圖1 VEGF和E-cadherin mRNA的表達(dá)Fig.1 Expression of VEGF and E-cadherin mRNA

2.2 VEGF和E-cadherin蛋白的表達(dá)

VEGF在胃癌組織細(xì)胞核染色呈強(qiáng)陽(yáng)性；在無(wú)癌胃黏膜細(xì)胞核中呈陰性或者弱陽(yáng)性（圖2）。胃癌組織中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)癌胃黏膜組織（P＜0.01），陽(yáng)性表達(dá)率分別為78.6%（44/70）和14.3%（4/34）。E-cadherin在無(wú)癌胃黏膜組織中的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，而在胃癌組織中呈陰性。無(wú)癌胃黏膜組織中E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于胃癌組織，陽(yáng)性表達(dá)率分別為91.4%（32/34）和22.9%（16/ 70），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

圖2 正常組織和胃癌組織中E-cadherin和VEGF的表達(dá)情況免疫組化×400Fig.2 VEGF and E-cadherin expression in normal tissue and gastric cancer tissue Immunohistochemistry×400

圖3 VEGF和E-cadherin蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of VEGF and E-cadherin protein

2.3VEGF和E-cadherinmRNA表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

VEGFmRNA表達(dá)水平在細(xì)胞分化程度高、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)T3、T4及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者的腫瘤組織中較細(xì)胞分化程度低、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)T1、T2及TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者顯著升高（P＜0.04）；而E-cadherinmRNA（P＜0.04）則相反。而且二者與患者性別、年齡及腫瘤大小均無(wú)關(guān)（P＞0.04）。見表1。

表1 VEGF和E-cadherin mRNA表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系Tab.1 Relationship of VEGF and E-cadherin mRNA expression and clinicopathological parameters

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要致死原因，因此對(duì)侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)因子進(jìn)行研究對(duì)腫瘤的治療有著十分重大的意義。腫瘤的侵襲過程極其復(fù)雜，也是發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的起始。它主要與腫瘤細(xì)胞的黏附、運(yùn)動(dòng)、增殖以及腫瘤血管的形成有關(guān)。

在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤新生血管的形成過程是其中的關(guān)鍵因子之一。VEGF可以促進(jìn)血管的形成，為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了適宜條件。VEGF作用于內(nèi)皮細(xì)胞，主要通過以下3個(gè)方面的作用調(diào)控體內(nèi)腫瘤血管的形成：促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，刺激內(nèi)皮細(xì)胞使血漿蛋白形成蛋白凝塊，提高血管的管壁通透性。之前已有研究表明，VEGF在胃癌中呈高表達(dá)，而在正常胃黏膜上皮的表達(dá)呈陰性。研究表明，隨著胃癌的分期和轉(zhuǎn)移情況，VEGF呈不同程度的表達(dá)［3，4］。T3、T4期的表達(dá)高于T1、T2期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組［4，6］。這都提示VEGF在胃癌的新生血管表現(xiàn)活躍，為腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。而相應(yīng)的腫瘤的發(fā)生和發(fā)展也會(huì)促進(jìn)VEGF的表達(dá)過量，因此VEGF的表達(dá)與胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有著密不可分的相關(guān)性［7，8］。

此外，細(xì)胞的黏附系統(tǒng)也對(duì)癌細(xì)胞脫離原發(fā)灶有著重要的作用，癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生黏附是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的起始步驟。正常的細(xì)胞必須通過細(xì)胞黏附維持生長(zhǎng)，而許多癌細(xì)胞可以無(wú)需黏附而呈現(xiàn)散落狀態(tài)，并且不發(fā)生凋亡。導(dǎo)致這種狀態(tài)的原因是因?yàn)榘┘?xì)胞能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的凋亡。而細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移是因?yàn)轲じ脚c非黏附過程失去了平衡。當(dāng)腫瘤發(fā)生局部浸潤(rùn)時(shí)，癌細(xì)胞之間的黏附能力降低。E-cadherin是介導(dǎo)黏附作用的因子之一，屬于細(xì)胞膜的整合蛋白，在上皮細(xì)胞中分布廣泛。它參與細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的作用，其表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞脫離原發(fā)灶，發(fā)生轉(zhuǎn)移和局部浸潤(rùn)。有研究表明，E-cadherinmRNA在胃癌中的表達(dá)明顯低于正常胃黏膜上皮細(xì)胞［9～11］。并且其低表達(dá)與TNM分期、胃癌組織分化程度低及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異比較呈高度相關(guān)。還有文獻(xiàn)報(bào)道E-cadherin基因（CDH1）與晚期胃癌中常見的雜合性缺失有關(guān)，與生存率低、預(yù)后較差緊密聯(lián)系。該基因的異常表達(dá)主要與CDH1發(fā)生基因突變、異常的轉(zhuǎn)錄功能和翻譯功能、甲基化的啟動(dòng)緊密相關(guān)，因此研究E-cadherin在組織中的表達(dá)可為臨床分析腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供可靠的診斷依據(jù)。

本研究檢測(cè)胃癌組織和無(wú)癌胃黏膜組織中VEGF和E-cadherinmRNA和蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)癌胃黏膜組織（P＜0.01），無(wú)癌胃黏膜組織中E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于胃癌組織（P＜0.01）。為了進(jìn)一步證實(shí)VEGF和E-cadherin在胃癌組織和無(wú)癌胃黏膜組織中的表達(dá)情況，又采用RT-PCR法對(duì)二者mRNA含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGFmRNA在胃癌組織中的表達(dá)量高于無(wú)癌胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；E-cadherinmRNA在無(wú)癌胃黏膜組織中的表達(dá)量高于胃癌組織（P＜0.01）。

結(jié)合以往及本研究結(jié)果，推測(cè)在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中有可能刺激了腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，而細(xì)胞的黏附作用降低，所以導(dǎo)致了細(xì)胞的持續(xù)增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移。有關(guān)VEGF和E-cadherin與胃癌臨床病理特征關(guān)系的研究較少。有研究表明，二者與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF和E-cadherin的表達(dá)與腫瘤的分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度和分期有關(guān)（P＜0.04），而與年齡、性別、腫瘤大小無(wú)關(guān)（P＞0.04），這可能是因?yàn)閂EGF的增殖為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了有利的條件，而E-cadherin在胃癌組織中表達(dá)減少，導(dǎo)致細(xì)胞失去黏附能力而產(chǎn)生了高度的侵襲性，更易于轉(zhuǎn)移。

綜上，胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程是一個(gè)多步驟、多因素的復(fù)雜的動(dòng)態(tài)生物學(xué)過程，涉及到多種基因的細(xì)胞生物學(xué)行為的改變［12，13］。至今，相關(guān)的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制取得了巨大的進(jìn)展，但細(xì)胞內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子和細(xì)胞的黏附過程的機(jī)制尚不明了［14，14］。研究相關(guān)基因的功能為今后的靶點(diǎn)基因治療提供了重要依據(jù)。

［1］Jawhari A，Jordan S，Poole S，et al.Abnormal immunoreactivity of the E-cadherin-catenin complex in gastric carcinoma：relationship with patient survival［J］.Grastroenterology，1997，112（1）：46-44.

［2］王渝，柯昌庶，趙秋，等.E-cadherin，β-catenin，CyclinD1在胃腺癌中的表達(dá)及臨床意義［J］.世界華人消化雜志，2007，14（4）：403-407.

［3］吳生華，俞繼衛(wèi)，鄭林海，等.胃癌VEGF-C、VEGFR-3及CNTN-1的表達(dá)及其與淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系［J］.中國(guó)普通外科雜志，2010，19（10）：1064-1070.

［4］肖麗君，趙恩宏，趙爽，等.17-AAG對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)STAT3和VEGF表達(dá)的影響［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，42（1）：64-68.

［5］趙海濱，吳國(guó)忠，徐桂芳，等.胃癌組織中VEGF-C、VEGFD、MMP-9的表達(dá)變化及意義［J］.山東醫(yī)藥，2009，49（40）：18-20.

［6］陳錦章，謝劍明，李愛民，等.胃腺癌中HPSE、VEGF的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011，40（26），229-232.

［7］Kolev Y，Uetake H，Iida S，et al.Prognostic significance of VEGF expression in correlation with COX-2，microvessel density，and clinicopathological characteristics in human gastric carcinoma［J］.Ann Surg Oncol，2007，14（10）：2738-2747.

［8］譚詩(shī)云，沈克祥，沈磊，等.胃癌術(shù)前超聲內(nèi)鏡檢查與腫瘤血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的檢測(cè)分析［J］.中華普通外科雜志，2004，20（11）：713-714.

［9］任本，朱曉玉，徐令鴿，等.胃癌及癌前病變DNA含量及細(xì)胞增殖活性檢測(cè)的臨床意義［J］.中國(guó)腫瘤臨床，2003，30（1）：17-19.

［10］邵春奎，朱正綱，蘇祖蘭，等.胃癌組織中p43、c2Erb22、EG2FR、nm23、E-cadherin基因表達(dá)及預(yù)后價(jià)值［J］.癌癥，2000，19（4）：666-670.

［11］邢軍，徐垚，劉文天，等.胃癌相關(guān)基因gel的克隆及其功能預(yù)測(cè)［J］.中國(guó)腫瘤臨床，2004，32（20）：1148-1141.

［12］Yingying X，Yong Z，Zhenning W，et al.Role of heparanase-1 in gastric carcinoma invasion［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2009，10（1）：141-144.

［13］Dicken BJ，Graham K，Hamilton SM，et al.Lymphovascular invasion is associated with poor survival in gastric cancer：an application of gene expression and tissue array techniques［J］.Ann Surg，2006，243（1）：64-73.

［14］徐惠綿，王振寧，王劍峰，等.胃癌腹膜亞臨床轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物的檢測(cè)及臨床意義［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2001，81（17）：1083-1084.

［15］Satoh Y，Mori K，Kitano K，et al.Analysis for the combination expression of CK20，F(xiàn)ABP1 and MUC2 is sensitive for the prediction of peritoneal recurrence in gastric cancer［J］.Jpn J Clin Oncol，2012，42（2）：148-142.

（編輯 陳姜）

Expression of Vascular EndothelialGrowth Factor and E-cadherin in Gastric Cancerand the ClinicalSignificance

XUANJi-ze1，CHENDan1，SHIChang1，WENZhi-hong2，WANGHui3
（1.DepartmentofPathology，The FirstAffiliated HospitalofDalian MedicalUniversity，Dalian 116011，China；2.DepartmentofRadiology，The Fifth People’s HospitalofDalian，Dalian 116021，China；3.DepartmentofUltrasound，The FirstAffiliated HospitalofDalian MedicalUniversity，Dalian 116011，China）

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of vascular endothelial growth factor（VEGF）and E-cadherin in gastric cancer，and explore its clinicalsignificance.MethodsReal-time PCR and Western blotwere used to detectthe mRNA and protein expressions of VEGF and E-cadherin，and immunohistochemical method was used to analyze the positive rate.ResultsVEGF protein expression rates of gastric cancer tissue and normal tissue were 78.6%（44/70）and 14.3%（4/34），and the positive expression rates of E-cadherin protein were 22.9%（16/70）and 91.4%（32/34）respectively.The expression levels ofVEGFmRNA and protein were remarkably higher than those in control group（P＜0.01），and E-cadherin was opposed（P＜0.01）.Moreover，the expression levels were correlated with tumor differentiated degree，lymphatic metastasis，depth of invasion and TNM staging（P＜0.04）.ConclusionIn gastric cancer，the expression levels of VEGF was obviously increased and E-cadherin was decreased.Both VEGF and E-cadherin are involved in the appearance，progress and migration ofgastric cancer.

gastric cancer；cell proliferation；cell migration；vascular endothelial growth factor；E-cadherin

R734.2

A

0248-4646（2014）04-0324-04

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2012224020）

玄基澤（1964-），男，副主任醫(yī)師，碩士.

王輝，E-mail：lndlnsd@163.com

2014-01-20

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