孫健瑋，王劍松，劉子超，楊峻峰，馬輝，鄭立民

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，昆明650101；2.昆明學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系，昆明650214；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院泌尿外科，云南個(gè)舊661000）

前列腺癌PTEN蛋白與雄激素受體的表達(dá)

孫健瑋1，王劍松1，劉子超2，楊峻峰1，馬輝1，鄭立民3

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，昆明650101；2.昆明學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系，昆明650214；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院泌尿外科，云南個(gè)舊661000）

目的探討前列腺癌組織中張力蛋白同源第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶基因（PTEN）蛋白與雄激素受體（AR）的表達(dá)及其與臨床分期的關(guān)系。方法用RT-PCR方法分析30例前列腺增生癥和41例前列腺癌穿刺取材組織的PTEN和AR表達(dá)，經(jīng)Western blot方法驗(yàn)證，分析其與臨床分期的關(guān)系。結(jié)果與前列腺增生癥比較，前列腺癌組織中PTEN表達(dá)顯著降低（P＜0.01），且與臨床分期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.972，P＜0.01）；AR的表達(dá)在前列腺癌早期高于前列腺增生癥（P＜0.04），隨腫瘤臨床分期的增高呈顯著降低（P＜0.01）。在前列腺癌臨床分期增高的進(jìn)程中，PTEN與AR表達(dá)存在相關(guān)性（r=0.886，P＜0.04）。結(jié)論隨前列腺癌臨床分期的增高，PTEN蛋白與AR表達(dá)呈顯著減低，二者表達(dá)具有相關(guān)性。

張力蛋白同源第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶基因；雄激素受體；前列腺癌

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是老年男性常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)2012年前列腺癌新增病例占同期男性全部新增癌癥患者總數(shù)的28.4%，位居癌癥新發(fā)病率的首位，前列腺癌的診治及其發(fā)病機(jī)制的研究日益受到關(guān)注［1］。張力蛋白同源第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）屬于抑癌基因，其表達(dá)水平降低或丟失與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［2，3］。研究表明前列腺癌患者基因突變率或雜合缺失率顯著高于正常人［4，4］。雄激素受體（androgen receptor，AR）是雄激素代謝和作用的重要環(huán)節(jié)，具有調(diào)控前列腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分泌等功能，在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中其影響作用顯著［6］。AR的表達(dá)與PTEN是否存在相關(guān)性的研究少有報(bào)道。本研究通過比較PCa與前列腺增生癥（benign prostate hyperplasia，BPH）組織中PTEN和AR的表達(dá)差異及其相關(guān)性，以期探索PTEN與AR之間的關(guān)系，為前列腺癌發(fā)病機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本：收集前列腺癌組織標(biāo)本41例，并選取30例BPH組織標(biāo)本作為對(duì)照（對(duì)照組）。所有組織標(biāo)本為2012年10月至2013年9月昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院和第三附屬醫(yī)院超聲引導(dǎo)前列腺穿刺取材獲得，經(jīng)病理診斷證實(shí)。前列腺癌患者年齡61～82歲，中位數(shù)年齡69歲，所有研究對(duì)象未接受任何治療。標(biāo)本收集均經(jīng)患者及醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.1.2 臨床分期：根據(jù)AJCC和UICC推薦的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)［7］，將41例前列腺癌分為：Ⅰ期（T1a-cN0M0，T1-2aN0M0）1例，Ⅱ期（ⅡA：T1a-cN0M0，T2abN0M0；ⅡB：T2c N0M0，T1-2 N0M0）17例，Ⅲ期（T3ab N0M0）4例，Ⅳ期（T4 N0M0，T任何N1M0，T任何N0M1）19例。

1.1.3 試劑：組織總RNA提取試劑盒、cDNA一鏈合成試劑盒和R-T PCR試劑盒均購(gòu)自大連TakaRa公司。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物科技有限公司合成。兔抗PTEN、山羊抗AR和兔抗β-actin抗體購(gòu)自Santa cruz公司，小鼠抗兔和小鼠抗山羊IgG購(gòu)自美國(guó)KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 組織取材方法：41例PCa入組活檢取材的指征為直腸指診陽性；前列腺超聲或CT檢查提示低回聲結(jié)節(jié)或異常信號(hào)；PSA＞4 ng/mL。術(shù)前1 h清潔灌腸；術(shù)前術(shù)后各口服3 d抗生素：滅滴靈0.4 g，3次/d，氟哌酸0.2 g，2次/d。HITACHI EUB-7400彩色超聲診斷儀，V43W腔內(nèi)探頭使用頻率7～14 MHz；美國(guó)BARD自動(dòng)活檢槍，活檢射程24 cm，18 G×24 cm穿刺針，取材長(zhǎng)度14～19 cm。患者取側(cè)臥位，會(huì)陰部及直腸消毒后采用系統(tǒng)10點(diǎn)穿刺法［8］，在標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)6點(diǎn)（前列腺旁正中線矢狀切面尖部、中部、底部）基礎(chǔ)上，兩外側(cè)各增加2針（外側(cè)周緣中部、底部），同時(shí)對(duì)超聲所見可疑回聲區(qū)隨機(jī)增加穿刺點(diǎn)。30例BPH入組患者為活檢穿刺后病理診斷前列腺增生癥并排除PCa的患者。穿刺取材組織離體后1份立即存入液氮作相關(guān)檢測(cè)，1份經(jīng)10%甲醛固定后送病理檢驗(yàn)。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)：用組織總RNA提取試劑盒提取樣品總RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度。cDNA一鏈合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并Real Time PCR-SYBR Green試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：首先94℃3 min變性，然后進(jìn)行40個(gè)PCR循環(huán)，循環(huán)條件為：94℃30 s變性，44℃20 s退火，72℃20 s延伸。PTEN序列引物為：上游4′-CTTGACCAATGGC TAAGTGAAGATG-3′，下游4′-GCACATATCATTAC ACCAGTTCGTCC-3′。AR序列引物為：上游4′-AGAAGACCTGCCTGATCTGTGGAGA-3′，下游4′-TCTTTTGAAGAAGACCTTGCAGCTTC-3′。內(nèi)參β-ACTIN的序列引物為：上游4′-CAAGGCCAACCGCG AGAAGA-3′，下游4′-GGGATAGCACAGCCTGGAT AGCA-3′。反應(yīng)體系為20 μL，用Bio-Rad公司IQ4熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.3 Western blot檢測(cè)：組織經(jīng)裂解液裂解并離心提取蛋白質(zhì)，Bio-rad蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。等量的總蛋白經(jīng)煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，4%奶粉溶液封閉2 h，一抗（兔抗PTEN，山羊抗AR和兔抗β-actin抗體）孵育過夜，二抗（小鼠抗兔和小鼠抗山羊IgG）孵育4 h，滴加適量ECL化學(xué)發(fā)光底物，顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，PTEN和AR在不同臨床分期之間的表達(dá)相關(guān)性用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析，P＜0.04為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌PTEN的表達(dá)

將PCa臨床Ⅰ期和Ⅱ期患者合并為1組（共18例），Ⅲ期和Ⅳ期患者合并為1組（共23例），與對(duì)照組比較，PCa（Ⅰ+Ⅱ）組和（Ⅲ+Ⅳ）組的PTEN表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）。隨著臨床分期的增加，PTEN表達(dá)量呈減少趨勢(shì)（P＜0.01）。見表1，圖1。

2.2 前列腺癌AR的表達(dá)

與對(duì)照組比較，在PCa（Ⅰ+Ⅱ）組的AR表達(dá)顯著增加（P＜0.04），而在（Ⅲ+Ⅳ）組AR表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。見表1，圖1。

表1 各組PTEN及AR相對(duì)表達(dá)的比較Tab.1 The expression of PTEN and AR in different group

表1 各組PTEN及AR相對(duì)表達(dá)的比較Tab.1 The expression of PTEN and AR in different group

1）P＜0.01，2）P＜0.04 vs control；3）P＜0.01 vs groupⅠ+Ⅱ.

圖1 不同臨床分期前列腺癌PTEN和AR的表達(dá)Fig.1 The expression of PTEN and AR in different PCa’s clinical stage

2.3 相關(guān)性分析

Spearman等級(jí)相關(guān)性分析表明，PTEN的表達(dá)與前列腺癌臨床分期存在負(fù)相關(guān)（r=-0.972，P＜0.01）。隨前列腺癌臨床分期的增高，PTEN與AR表達(dá)存在相關(guān)性（r=0.886，P＜0.04）。

3 討論

前列腺癌常見于老年男性，其誘因包括遺傳、飲食、藥物、病源微生物等多種因素。抑癌基因缺失在前列腺癌早期發(fā)生過程中起著十分重要的作用。PTEN是繼p43后克隆到的腫瘤抑制基因之一，該基因突變或表達(dá)缺失與多種腫瘤發(fā)生相關(guān)［9，10］。PTEN具有磷酸化酶活性，能通過多種途徑抑制腫瘤發(fā)生，如抑制PI3K/AKT信號(hào)通路、使FAK去磷酸化以及抑制MAPK信號(hào)通路等［11～14］。PTEN在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞黏附和轉(zhuǎn)移等作用也日益受到關(guān)注［14］。本研究結(jié)果表明PTEN表達(dá)與PCa的發(fā)生有關(guān)：PCa組織中PTEN表達(dá)顯著低于BPH，而且隨著PCa臨床分期的增高，PTEN表達(dá)呈降低的趨勢(shì)，提示PTEN對(duì)PCa的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用。Grasso等［16］研究表明PTEN基因的改變是PCa發(fā)生的早期事件，PTEN基因缺失或者表達(dá)降低引起一系列相關(guān)基因表達(dá)模式改變，最終引起細(xì)胞增殖失控產(chǎn)生癌變。

AR是雄激素的主要分子靶標(biāo)，存在于成人前列腺間質(zhì)細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。AR通過直接與DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，在男性生殖器官形成、第二性征發(fā)育、蛋白質(zhì)合成代謝、骨骼和肌肉的發(fā)育等多方面發(fā)揮重要的功能［17，18］。研究結(jié)果表明PCa的發(fā)生與AR表達(dá)改變相關(guān)，AR過量表達(dá)能促進(jìn)前列腺細(xì)胞增殖，并最終導(dǎo)致早期PCa的發(fā)生［19］。大多數(shù)PCa病程的早期呈現(xiàn)對(duì)雄激素的依賴而激素阻斷治療有效，經(jīng)歷18～24個(gè)月后這種激素阻斷治療效果極為有限［20］，表現(xiàn)為腫瘤對(duì)雄激素的非依賴性（即激素非依賴性前列腺癌）。盡管目前關(guān)于前列腺癌組織中AR表達(dá)情況的研究結(jié)果不一，但AR在前列腺癌的激素依賴向激素非依賴的轉(zhuǎn)化過程中具有重要作用是具有共識(shí)的［21］。本研究結(jié)果顯示：在PCa發(fā)生早期，AR的表達(dá)較BPH組織中的表達(dá)顯著增加，但隨著腫瘤臨床分期的增高，AR的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，甚至低于BPH。該結(jié)果與國(guó)內(nèi)部分研究報(bào)道一致［22，23］。

PCa的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)研究表明，PTEN基因缺失和AR過表達(dá)都能引起前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展［16］。本研究結(jié)果表明，PTEN與AR表達(dá)存在相關(guān)性，而AR的表達(dá)受多種機(jī)制的調(diào)控，PTEN可能是影響AR表達(dá)的因素之一。PCa組織中PTEN和AR隨腫瘤臨床分期增高而表達(dá)減低的趨勢(shì)，可作為PCa診斷和療效判斷的參考指標(biāo)。

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（編輯 武玉欣）

The Expression of PTENProtein and Androgen Receptor in Prostate Cancer

SUNJian-wei1，WANGJian-song1，LIUZi-chao2，YANG Jun-feng1，MAHui1，ZHENGLi-min3
（1.Department of Urology，the Second Affiliated Hospital，Kunming Medical University，Kunming 640101，China；2.Department of Biologican Science and Technology，Kunming University，Kunming 640214，China；3.DepartmentofUrology，the Fifth Affiliated Hospital，Kunming MedicalUniversity，Gejiu 661000，China）

ObjectiveTo study the expression of PTEN protein and androgen receptor（AR）in prostate cancer and their relationship with clinical stage.MethodsThe expression of PTEN and androgen receptor were detected by RT-PCR and Western blot in 30 benign prostate hyperplasia（BPH）and 41 prostate cancer（PCa）samples.The relativity was analyzed on the basis of clinical stage.ResultsCompare to BPH，the expression of PTEN was significantly lower in PCa（P＜0.01）.The expression of PTEN was negatively related to clinical stage（r=-0.972，P＜0.01），and the expression ofAR in early PCa was higherthan BPH（P＜0.04），butitappears significantdecrease in the advanced clinicalstage（P＜0.01）.The expression ofPTENcorrelated with ARexpression in the advanced clinicalstage（r=0.886，P＜0.04）.ConclusionThe expression ofPTENand AR in PCa was lowersignificantly than in BPH in the advanced clinicalstage，there was relativity between the expression ofPTENand AR.

phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten；androgen receptor；prostate cancer

R737.24

A

0248-4646（2014）03-0316-04

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究資助項(xiàng)目（2013FZ282）

孫健瑋（1968-），男，主任醫(yī)師，博士研究生.

王劍松，E-mail：Jiansongwang@yahoo.com

2013-12-30

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：