王昌釗，郭婕，吳雙民，李仁勇

[1.陜西出入境檢驗檢疫局，西安 710068； 2.西安市糧油質(zhì)量檢驗中心，西安 710003； 3.賽默飛世爾科技(中國)有限公司，北京 100080]

有機(jī)酸存在廣泛，種類繁多，是影響果汁口感和風(fēng)味的重要物質(zhì)。果汁中有機(jī)酸含量的高低與果汁產(chǎn)品品質(zhì)有密切的關(guān)系［1］，同時也受到生產(chǎn)技術(shù)和加工工藝的影響。乳酸是評價果汁產(chǎn)品質(zhì)量的一項重要指標(biāo)。在乳酸菌的作用下，果汁中的碳水化合物發(fā)酵生成乳酸。富馬酸一般是在合成蘋果酸的過程中產(chǎn)生，因此若蘋果汁中含有富馬酸，則有可能添加合成蘋果酸。過度的加工條件也可能產(chǎn)生富馬酸，例如果汁濃縮過程中，蘋果酸受熱就會生成富馬酸。因此相同條件下生產(chǎn)的鮮榨蘋果汁往往比濃縮蘋果汁含有較少的富馬酸。蘋果汁中檸檬酸的含量同樣也具有重要的特征和意義，當(dāng)其超出一定的值(RSK值)，則表示該果汁是摻假蘋果汁。因此一些進(jìn)口國對蘋果汁中的有機(jī)酸提出了比較嚴(yán)格的要求，如歐盟果蔬汁飲料協(xié)會(AIJN)［2］規(guī)定蘋果汁中乳酸的含量不得超過0.5 g／L (11.2 Brix)，富馬酸的含量不得超過5.0 mg／L(11.2 Brix)，檸檬酸的含量應(yīng)在50～150 mg／L之間，其它一些國家也有類似規(guī)定。

有機(jī)酸的分析方法通常有極譜法［3］、容量法［4–5］、分光光度法［6–8］、氣相色譜法［9–10］、高效液相色譜法［11–15］、離子色譜法［16–20］等。農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)《果汁測定方法 乳酸的測定》是試樣經(jīng)脫糖氧化后蒸餾，用碘量滴定法測定［4］?！豆瓬y定方法 檸檬酸的測定》則是將有機(jī)酸以鋇鹽形式分離以后，利用檸檬酸與重氮化磺胺酸的特效反應(yīng)，利用分光光度法比色測定［6］。以上檢測步驟繁瑣，所用試劑較多，花費時間過長。高效液相色譜法雖可以同時測定乳酸、檸檬酸、富馬酸，但由于有機(jī)酸沒有末端吸收，需要長時間穩(wěn)定紫外檢測器，且方法的分離度和靈敏度偏低，在實際樣品分析時乳酸分離效果并不理想。離子色譜儀配備抑制型電導(dǎo)檢測器，檢測有機(jī)酸的靈敏度較高，因此筆者采用離子色譜法測定了果汁中的乳酸、檸檬酸、富馬酸，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：Dionex ICS–5000型，附帶Chromeleon工作站，美國賽默飛公司；

淋洗液發(fā)生罐：EGC–KOH Ⅲ型，美國賽默飛公司；

乳酸、富馬酸、檸檬酸：優(yōu)級純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；

OnGuard II RP固相萃取小柱：1.0 mL，美國賽默飛公司；

濃縮蘋果汁、濃縮梨汁：陜西出口產(chǎn)品；

實驗用水為超純水(電阻率不小于18.2 MQ·cm)。

1.2 色譜條件

色譜柱：Dionex IonPac AS19型(250 mm×4 mm，美國賽默飛公司)；保護(hù)柱：IonPac AG19型(250 mm×4 mm，美國賽默飛公司)；流動相：氫氧化鉀溶液，梯度淋洗，氫氧化鉀溶液濃度0～15 min為2 mmol／L，15～30 min為2～40 mmol／L，30～40 min為40 mmol／L，40～43 min為2 mmol／L，流量為1 mL／min；抑制器：連續(xù)自動再生膜陰離子抑制器；檢測方式：抑制型電導(dǎo)檢測器(配ASRS 300型微膜電抑制器，自循環(huán)電抑制，抑制電流為99 mA)；柱溫：30℃，進(jìn)樣體積：25 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取一定量的乳酸、富馬酸、檸檬酸，用超純水配成1 000 mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中乳酸的濃度是混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)加熱回流15 h后，以氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行標(biāo)定所得。

1.4 樣品的制備

果汁樣品的制備：準(zhǔn)確量取6 mL樣品(精確至0.05 mL)置于50 mL容量瓶中，用超純水稀釋定容到標(biāo)線，搖勻后過0.22 μm尼龍濾膜和On-guard II RP固相萃取小柱(小柱使用前分別用5 mL甲醇和10 mL去離子水以2 mL／min的流速活化)，棄去3 mL初濾液，續(xù)濾液收集后進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱及淋洗條件的選擇

蘋果汁中3種待測有機(jī)酸成分中，乳酸的色譜保留非常弱，富馬酸和檸檬酸則保留非常強(qiáng)，色譜柱選擇時需兼顧3者的分離效果。常用的陰離子交換體系主要有兩種：碳酸鹽和氫氧化物。以氫氧根為淋洗液的色譜柱其固定相官能團(tuán)烷醇基季銨鹽的親水性比碳酸鹽體系柱對應(yīng)官能團(tuán)烷基季銨鹽強(qiáng)，對強(qiáng)保留組分陰離子具有更好的洗脫能力。因為氫氧化物體系具有強(qiáng)堿性，多價離子以高價離子形態(tài)存在，色譜峰形對稱尖銳，靈敏度高。綜上兩點，選擇使用氫氧根體系色譜柱。比較了7種最常見的AS11–HC，AS15，AS16，AS17，AS18，AS19，AS20色譜柱。實驗發(fā)現(xiàn)，AS11–HC色譜柱對多種有機(jī)酸的同時分析具有優(yōu)勢，但是對于乳酸、乙酸和氟分離度較差，草酸和富馬酸也很難實現(xiàn)基線分離，其余如AS16，AS17都有類似的分離情況。AS15，AS18和AS20上則對乳酸、乙酸分離較差。在AS19柱上乳酸與常見有機(jī)酸能實現(xiàn)基線分離，富馬酸和檸檬酸也基本不存在干擾，因此選擇AS19柱對淋洗條件進(jìn)一步優(yōu)化。最終確定氫氧化鉀溶液梯度淋洗條件：0～15 min，2 mmol／L；15～30 min，2～40 mmol／L；30～40 min，40 mmol／L；40.1～43 min，2 mmol／L。在此條件下，樣品中有機(jī)酸的分離度基本都能達(dá)到1.5以上，離子色譜圖見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液離子色譜圖

2.2 方法的檢出限、定量限和線性方程

按照有機(jī)酸的色譜響應(yīng)特性，配制系列乳酸、富馬酸、檸檬酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2節(jié)色譜條件進(jìn)行測定，以各待測物的平均色譜峰面積y對其質(zhì)量濃度x(mg／L)進(jìn)行回歸，其線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表1。由表1可知，3種待測有機(jī)酸在各自的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999。采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的信噪比(S／N)等于3確定檢出限(LOD)，S／N等于10確定定量限(LOQ)，得到3種有機(jī)酸的LOD和LOQ見表2?？紤]到樣品前處理的稀釋倍數(shù)，可換算得到樣品(11.2 Brix)中測定低限(定量限)分別為0.5，0.3，0.2 mg／L。

表1 方法的檢出限、定量限和線性范圍

2.3 精密度試驗

按照1.3方法對樣品進(jìn)行前處理，按1.2色譜條件直接在離子色譜系統(tǒng)上進(jìn)樣分析，外標(biāo)法定量。對典型的濃縮蘋果汁和脫色蘋果汁樣品溶液重復(fù)處理6次，分別進(jìn)樣測試，乳酸和檸檬酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.41%～0.63%之間，富馬酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.43%，1.45%，結(jié)果見表2，表明方法具有良好的重現(xiàn)性。

表2 方法的精密度

2.4 回收試驗

在典型蘋果汁樣品溶液(濃縮蘋果清汁和脫色蘋果汁)中添加乳酸、檸檬酸、富馬酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，結(jié)果見表3。

表3 方法的加標(biāo)回收率

由表3可知，加標(biāo)回收率為90.7%～102.8%，表明方法具有良好的準(zhǔn)確度。濃縮蘋果清汁樣品色譜圖見圖2。

圖2 濃縮蘋果清汁樣品譜圖

按此方法測試了多種果汁樣品中的乳酸、富馬酸和檸檬酸含量，表4中列出了幾種典型樣品的測試結(jié)果。

表4 樣品中乳酸、富馬酸、檸檬酸的檢出結(jié)果

3 結(jié)語

離子色譜法測定蘋果汁中的乳酸、檸檬酸和富馬酸，具有良好的分離能力。對于富馬酸的定量限可以達(dá)到0.2 mg／L(11.2 Brix)，可滿足AIJN［2］的檢測要求5 mg／L(11.2 Brix)，靈敏度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)液相色譜法。該方法簡便、可靠，精密度好，成本低，此方法也可適用于其它果汁、飲料、白酒、葡萄酒中有機(jī)酸的測定。

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