周嚴(yán)嚴(yán)，趙睜睜，2，郭小藤，容蓉，呂青濤，鞏麗麗，楊勇

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250355； 2.壽光市中醫(yī)醫(yī)院，山東濰坊 262700）

中藥復(fù)方芎?湯出自《千金方》［1］，由當(dāng)歸和川芎等組成，具有養(yǎng)榮活血的功效［2］，主治妊娠傷胎、包衣不下、難產(chǎn)等證。當(dāng)歸、川芎合用為臨床常用補(bǔ)血活血藥對(duì)［3］。當(dāng)歸和川芎存在共同的有效成分，如藁本內(nèi)酯、阿魏酸等。此外當(dāng)歸中還有當(dāng)歸多糖、揮發(fā)油、氨基酸、微量元素等［4–5］；川芎中還有生物堿、川芎嗪、酚類物質(zhì)、有機(jī)酸、苯酞內(nèi)酯及其它成分［6］。由于中藥及復(fù)方成分的復(fù)雜性，中藥復(fù)方代謝規(guī)律的研究一直是個(gè)難點(diǎn)。目前的探究主要是針對(duì)其中一種或幾種活性成分，研究其在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及代謝規(guī)律。中藥復(fù)方的藥效作用是多成分協(xié)同作用的結(jié)果，故對(duì)芎?湯活血有效部位排泄規(guī)律的研究，亦應(yīng)針對(duì)多成分考察其總體排泄趨勢(shì)。指紋圖譜技術(shù)能較全面地反映中藥整體化學(xué)特征［7］，測(cè)定給藥動(dòng)物排泄物的HPLC指紋圖譜，將有助于掌握中藥多成分的排泄信息。歐氏距離對(duì)于化學(xué)指紋圖譜相似性具有較好的綜合評(píng)價(jià)能力［8］。前期研究發(fā)現(xiàn)，芎?湯大孔樹(shù)脂分離制備的40%乙醇洗脫部位（40% Ethanol Elution Part，簡(jiǎn)稱EE40部位）中有效成分阿魏酸含量高［9］，該部位可增強(qiáng)紅細(xì)胞膜的流動(dòng)性，改善急性期缺血的能量代謝障礙的狀態(tài)，防止心肌的進(jìn)一步壞死，是芎?湯主要活血有效部位［10］。筆者采用HPLC指紋圖譜技術(shù)，測(cè)定芎?湯活血有效部位（EE40部位）給藥前后大鼠尿樣、糞樣多成分的總體變化趨勢(shì)，以期闡明芎?湯活血有效部位在大鼠體內(nèi)的總體排泄規(guī)律。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1200型，附DAD檢測(cè)器，四元低壓梯度泵，柱溫箱，美國(guó)安捷倫公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ–5200DB型，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；

CO2超臨界萃取儀：Spe-ed SFE型，美國(guó)ASI公司；

電子分析天平：（1）FA1004B型，感量為0.1 mg，上海越平科學(xué)儀器有限公司；（2）AF240型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE–52C型，上海亞榮生化儀器廠；

電動(dòng)植物粉碎機(jī)：DWF–100型，河北省黃驊市科研機(jī)械廠；

勻漿器：SZ–1型，江蘇金壇市國(guó)勝儀器廠；

當(dāng)歸、川芎飲片：批號(hào)分別為20100821，20100911，濟(jì)南建聯(lián)藥店；

大孔吸附樹(shù)脂：D101型，滄州寶恩吸附材料科技有限公司；

阿魏酸對(duì)照品：批號(hào)為0773–9910，中國(guó)藥品生物制品檢定所；

藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞對(duì)照品：批號(hào)分別為110773–200912，110773–201002，110773–201010，成都瑞芬思生物科技有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

實(shí)驗(yàn)用水為市售純凈水；

實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠：雄性，體重280～300 g，許可證號(hào)為SYXK(魯)2011–0002，山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 芎?湯活血有效部位灌胃溶液的制備

將當(dāng)歸、川芎藥材粉碎，過(guò)0.85 mm（20目）篩，分別取250 g，混合，加12倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液，回收乙醇，濃縮至1 L，制得芎?湯醇提液（每毫升溶液相當(dāng)于0.5 g生藥材）。取醇提液，以1∶3（藥材質(zhì)量與樹(shù)脂體積比）的比例過(guò)D101大孔樹(shù)脂柱，分別用10倍量的水，20%，40%，60%，95%乙醇依次洗脫，收集不同濃度的乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，分別濃縮至500 mL（每毫升樣品溶液相當(dāng)于1 g生藥材）。前期研究發(fā)現(xiàn)芎?湯活血有效部位主要集中在40%乙醇洗脫部分。取40%乙醇洗脫部分水浴低溫濃縮至近干，加少許吐溫80，用水溶解，超聲使之分散均勻，定容至100 mL，得芎?湯活血有效部位灌胃藥液［8］（相當(dāng)于原藥材5 g／mL）。

1.3.2 色譜條件

色 譜 柱：ZORBAX SB–C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈–0.5%乙酸混合液，流量為1.0 mL／min；進(jìn)樣體積：20 μL；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：292 nm；參比波長(zhǎng)：360 nm。

流動(dòng)相梯度洗脫步驟見(jiàn)表1。

1.4 大鼠尿、糞樣品采集與處理

1.4.1 灌胃給藥

將SD大鼠12只置于代謝籠中，收集空白尿樣和空白糞樣；實(shí)驗(yàn)前禁食（不禁水）12 h，取芎?湯活血有效部位灌胃藥液，以40 g／kg的劑量灌胃給藥，收集給藥后0～4 h，4～8 h，8～12 h，12～24 h，24～36 h，36～48 h，48～60 h，60～72 h，72～84 h，84～96 h各時(shí)間段的尿樣和糞樣。尿樣記錄體積，糞樣稱重，于–20℃冷凍保存。

1.4.2 尿樣處理

取尿樣400 μL，甲醇200 μL，乙睛1 mL，渦流30 s，以4 000 r／min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液1 mL，濃縮至干，加甲醇100 μL，溶解，以10 000 r／min轉(zhuǎn)速高速離心，取上清液。

1.4.3 糞樣處理

取糞樣0.5 g （濕重，總質(zhì)量不足0.5 g的則全?。┯谠嚬苤校尤爰状迹S樣重量–甲醇體積之比為1∶4）后勻漿，超聲、離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r／min）各10 min，取上清液400 μL，加入甲醇200 μL，乙腈1 mL，渦旋30 s，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r／min）10 min，取上清液1 mL，濃縮至干，加甲醇100 μL溶解，以10 000 r／min高速離心，取上清液即得。

1.5 實(shí)驗(yàn)步驟

提取給藥后尿、糞樣品的HPLC指紋圖譜中峰面積有明顯變化的色譜峰和新增的色譜峰作為特征峰，以特征峰面積為指標(biāo)，計(jì)算不同時(shí)間段收集的尿樣、糞樣給藥前后HPLC指紋圖譜的歐氏距離，考察給藥前后不同時(shí)間段尿樣、糞樣的相似性。

2 結(jié)果與討論

2.1 穩(wěn)定性及精密度試驗(yàn)

取給藥后12～24 h時(shí)間段采集的尿樣，按照1.4.2方法處理后，在1.3.2色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，每隔2 h進(jìn)樣一次，10 h內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，考察精密度和樣品10 h內(nèi)的穩(wěn)定性。選擇9個(gè)特征指紋峰進(jìn)行考察，以5號(hào)峰為參比峰，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和特征峰面積為指標(biāo)進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2相關(guān)數(shù)據(jù)得知，特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%，表明HPLC指紋圖譜測(cè)定精密度良好，樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 EE40部位給藥尿液指紋圖譜特征峰穩(wěn)定性及精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.2 大鼠尿樣HPLC指紋圖譜

比較EE40部位給藥前后不同時(shí)間段的大鼠尿樣HPLC指紋圖譜差異，將按照1.4.2處理所得尿樣在1.3.2色譜條件下測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 EE40部位給藥前大鼠尿樣HPLC指紋圖譜

圖2 EE40部位給藥后大鼠尿樣HPLC指紋圖譜

2.3 大鼠糞樣HPLC指紋圖譜

比較EE40部位給藥前后不同時(shí)間段的大鼠糞樣HPLC指紋圖譜差異，將1.4.3處理的糞樣樣品按1.3.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖分別見(jiàn)圖3、圖4。

2.4 HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)

EE40部位給藥后尿樣和糞樣HPLC特征峰面積數(shù)據(jù)見(jiàn)表3、表4。

圖3 EE40部位給藥前大鼠糞樣HPLC指紋圖譜

圖4 EE40部位給藥后大鼠糞樣HPLC指紋圖譜

2.5 HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)處理結(jié)果

聚類分析是用多元統(tǒng)計(jì)技術(shù)進(jìn)行分類的一種方法。目前多維空間里的兩樣本距離的計(jì)算方法主要有歐氏距離、馬氏距離、閔氏距離等，其中以歐氏距離最常用。對(duì)n個(gè)含m個(gè)指標(biāo)的樣本，可定義為m維空間的點(diǎn)，在m維空間中的任意兩點(diǎn)，其相似性可用“距離”度量，定義為“dij”，若將任一樣本看作一類，其類間相似性可用歐氏距離DE表示［11］。將給藥后不同時(shí)間段采集的樣品作為i樣本、給藥前樣品作為j樣本，以HPLC特征峰面積為指標(biāo)，計(jì)算不同時(shí)間段收集的尿樣、糞樣給藥前后HPLC指紋圖譜的歐氏距離DE，以歐氏距離DE表征各樣本指紋圖譜間的相似性，考察樣本中多成分的總體變化趨勢(shì)。

表3 EE40部位給藥后尿樣的HPLC特征峰面積(n=6) mAU

表4 EE40部位給藥后糞樣的HPLC特征峰面積(n=6) mAU

式中：l—樣本指標(biāo)數(shù)，即特征峰個(gè)數(shù)l=1，2，3…m；

i，j——樣本序號(hào)，即不同時(shí)間段采集的樣本；

xil，xjl——樣本各指標(biāo)，即特征峰面積。

以DE為縱坐標(biāo)、給藥后的取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)繪圖，DE數(shù)據(jù)見(jiàn)表5，尿樣、糞樣DE與取樣時(shí)間關(guān)系分別見(jiàn)圖5、圖6。

由圖5和圖6可知，大鼠EE40部位給藥后尿樣在8～12 h內(nèi)有顯著變化，表明總體成分的腎臟排泄在此時(shí)間段達(dá)到高峰，60 h后排泄量很少，96 h基本排泄完全；糞樣在12～24 h內(nèi)有顯著變化，證明總體成分的腸道排泄在此時(shí)間段達(dá)到高峰，72 h后排泄量很少，84 h基本排泄完全。該研究為臨床制定更為合理的用藥方案提供依據(jù)。

表5 EE40部位給藥前后大鼠尿樣、糞樣的歐氏距離DE

圖5 EE40部位給藥后尿樣HPLC指紋圖譜特征峰歐氏距離變化曲線

圖6 EE40部位給藥后糞樣HPLC指紋圖譜特征峰歐氏距離變化曲線

3 結(jié)語(yǔ)

采用歐氏距離綜合反映不同時(shí)間段給藥動(dòng)物尿樣、糞樣HPLC指紋圖譜多個(gè)特征峰的整體變化，更加符合中藥整體作用的特點(diǎn)；以色譜峰保留時(shí)間和峰面積為指標(biāo)，通過(guò)與給藥前空白尿、糞樣品指紋圖譜比較，發(fā)現(xiàn)給藥后尿、糞樣品的HPLC指紋圖譜的色譜峰，部分與給藥前樣品相同，屬內(nèi)源性成分；部分為新增加的色譜峰，可能來(lái)自芎?湯活血藥效部位的原成分及其代謝產(chǎn)物。這些成分的歸屬和結(jié)構(gòu)確定有待于進(jìn)一步研究。

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