馬增煌

A1蛋白與前列腺特異性抗原在前列腺癌與前列腺增生疾病中聯(lián)合檢測的意義

馬增煌

目的選取50～70歲之間的前列腺增生、前列腺癌患者和健康對(duì)照者，對(duì)其血液中A1蛋白的表達(dá)與PSA的表達(dá)水平進(jìn)行比較分析，為前列腺增生和前列腺癌的臨床鑒別診斷提供依據(jù)。方法采用電化學(xué)發(fā)光儀檢測PSA濃度，采用反轉(zhuǎn)錄酶?聚合酶鏈鎖反應(yīng)（RT?PCR）技術(shù)和蛋白免疫印跡法（western?blot）檢測20例前列腺癌患者、20例前列腺增生患者和20例正常者新鮮前列腺組織中A1mRNA和蛋白的表達(dá)情況，探討A1蛋白表達(dá)與前列腺增生和前列腺癌中PSA表達(dá)水平的關(guān)系。結(jié)果RT?PCR與westem?blot檢測結(jié)果一致，A1蛋白在前列腺增生組織和前列腺癌組織中均有陽性表達(dá)，前列腺癌組織中A1蛋白陽性表達(dá)明顯高于前列腺增生組織，有顯著性差異（P＜0.01）。A1蛋白表達(dá)的陽性率與PSA的濃度相關(guān)。結(jié)論A1蛋白陽性表達(dá)程度與前列腺病變程度相關(guān)，A1蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中起著重要的作用，其過度表達(dá)在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。聯(lián)合檢測A1和PSA的表達(dá)變化對(duì)判斷前列腺癌的生物學(xué)行為有參考價(jià)值。

前列腺癌；前列腺增生；前列腺特異性抗原；A1蛋白

由男性重要的性腺器官前列腺引起的疾病在不同的年齡階段有不同的特點(diǎn)，老年人則多為前列腺增生（benign prostate hyperplasia BPH）及前列腺癌（prostate cancer），隨著年齡的增加，前列腺癌的發(fā)病率呈明顯增加的趨勢，前列腺癌是男性泌尿生殖系最常見的腫瘤。應(yīng)用前列腺特異抗原（prostatic specific antigen，PSA）進(jìn)行大規(guī)模前列腺癌篩查，是目前早期診斷前列腺癌的最有效方法。但其對(duì)前列腺癌的早期診斷仍有一定困難和偏差，容易漏診。分子生物技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)證明前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展是多種癌基因和抑癌基因共同作用的結(jié)果，我們可以從蛋白水平和基因水平檢測前列腺癌。本實(shí)驗(yàn)通過檢測A1蛋白的表達(dá)水平和PSA的濃度，以探討A1蛋白和PSA與前列腺癌和前列腺增生的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 組織標(biāo)本：收集黃石市中心醫(yī)院病理科2010～2013年前列腺標(biāo)本，患者年齡50～70歲，平均患者（62.7±0.31）歲，前列腺癌組織標(biāo)本（n＝20），前列腺增生組織標(biāo)本（n＝20），正常組前列腺組織標(biāo)本（n＝20），液氦保存。

血液標(biāo)本：無抗凝的采血管采集肘靜脈全血4ml，室溫靜置1 h凝固，然后4℃，2000 r／min離心10min，取出上層血清，分裝于聚丙烯EP管中，－80℃冰箱保存待測。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)液、小牛血清購自Gibco公司；Trizol、引物購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄酶?聚合酶鏈反應(yīng)（RT?PCR）試劑盒購自TOYOBO公司；100 bp DNA Ladder購自天為時(shí)代；蛋白抽提試劑盒購自Pierce公司；丙烯酰胺、N，N′?甲叉雙丙稀酰胺、TEMED、Tris、SDS、過硫酸銨、甘氨酸購自Promega公司；PVDF膜，BSA，BLAST試劑盒購自Perkin Elemer公司；鼠抗人A1單克隆抗體購自日本MBL公司；羊抗鼠IgG／HRP購自美國Proteintech Group公司，內(nèi)參anti?β?actin／HRP購自北京博奧森公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Roche公司。

1.3 PSA濃度的檢測 使用德國羅氏P800全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中的PSA濃度，采用電化學(xué)發(fā)光方法，標(biāo)本均為同批測定，以上檢測均受控于衛(wèi)生部臨檢中心、湖北省臨檢中心的室間質(zhì)評(píng)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 以含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.5 A1 mRNA表達(dá)

1.5.1 引物設(shè)計(jì)：應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)引物序列為：β2微球蛋白：正義鏈：5’?CTC ACG TCA TCC AGC AGA GA?3’，反義鏈：5’?CAA GCT TTG AGT GCA AGA GA?3’，目的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為629 bp；A1：正義鏈：5’?TACAGGCTGGCTCAGGACTAT?3’，反義鏈：5’?GATGCCGTCTTCAAACTCCTT?3’，目的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為222 bp。

1.5.2 RT?PCR cDNA的制備：在20μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（1μl AMV反轉(zhuǎn)錄酶，0.5μl RNase抑制劑，Random primer 1μl，3μl底物混合物）。反應(yīng)條件為：30℃10min；42℃20min；99℃5min；4℃5 min。PCR擴(kuò)增：分別加2種引物在50μl PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行同管擴(kuò)增（94℃2 min，1個(gè)循環(huán)；94℃15 s；52℃30 s；72℃延伸30 s；30個(gè)循環(huán)）。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠，加入10μl擴(kuò)增產(chǎn)物，150 V 25min電泳分離，紫外光下對(duì)凝膠進(jìn)行拍照，底片光密度掃描。

1.6 蛋白質(zhì)的提取和鑒定

1.6.1 總蛋白的提?。喝∨囵B(yǎng)12 h的細(xì)胞，1500 r／min離心5 min，加入細(xì)胞裂解液（8 mol／L尿素，40 g／L CHAPS，2 mmol／L TBP，2 m l／L Bio?Lyte），吹打均勻，4℃振搖30 min，收集細(xì)胞裂解液于EP管中，4℃2000 r／min離心1 h，取上清液用Bradford法行蛋白定量。

1.6.2 蛋白免疫印跡法（western?blot）檢測A1蛋白的表達(dá)：PVDF膜與鼠抗人A1單克隆抗體（1∶1000）室溫育膜60min；PBST緩沖液洗膜10min×3次；HRP標(biāo)記抗鼠二抗（1∶5000）育膜60 min，洗膜。將PVDF膜置于化學(xué)反應(yīng)液中5 min進(jìn)行顯色，取出，洗凈膜，將其放置熒光化學(xué)發(fā)光圖像分析儀中進(jìn)行曝光，采用Quantity?one分析系統(tǒng)檢測蛋白條帶的平均密度值，分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有結(jié)果均取自1次代表性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果被3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。所測計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，以SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，2組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺增生組、前列腺癌組和正常組血液中PSA水平比較 正常組PSA水平在正常范圍內(nèi)，平均濃度為（1.09±0.17）μg／L；前列腺增生組PSA平均濃度為（8.75±0.32）μg／L，45%患者PSA水平集中在4～10 μg／L范圍內(nèi)；前列腺癌組PSA平均濃度為（14.68± 1.02）μg／L，55%患者PSA水平集中在10～20μg／L。與正常組比較，前列腺增生組和前列腺癌組PSA水平顯著增高（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 不同PAS濃度范圍內(nèi)各組所占人數(shù)對(duì)比（n＝20）

2.2 A1 mRNA的表達(dá) 在正常組、前列腺增生組和前列腺癌組中，A1 mRNA均表達(dá)，PSA濃度在4～10 μg／L時(shí)，A1mRNA在前列腺增生組和前列腺癌組的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PSA濃度在10～20 μg／L時(shí)，A1 mRNA在前列腺癌組中的表達(dá)明顯高于正常組、前列腺增生組和PSA為4～10μg／L的前列腺癌組，差異具有顯著性（P＜0.01）（圖1）。

2.3 A1蛋白的表達(dá) A1蛋白的表達(dá)與PCR顯示的結(jié)果相一致，當(dāng)PSA濃度在10～20μg／L時(shí)，A1蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱與PSA的濃度呈正相關(guān)（圖2）。

圖1 RT?PCR檢測A1 mRNA

圖2 Westem?blot檢測A1蛋白的表達(dá)

3 討論

3.1 PSA在前列腺疾病中的意義 PSA是由前列腺上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，直接分泌到前列腺導(dǎo)管系統(tǒng)內(nèi)，它的正常功能是幫助精液凝塊水解液化，與男性生育功能有關(guān)［1］。正常的前列腺導(dǎo)管系統(tǒng)周圍存在血?上皮屏障，避免前列腺上皮產(chǎn)生的PSA直接進(jìn)入血液之中，從而維持了血液中PSA的低濃度。一般認(rèn)為，血清PSA濃度＜4 ng／m l為正常，＞10 ng／m l則患前腺癌的危險(xiǎn)性增加。當(dāng)前列腺發(fā)生癌變時(shí)可破壞血?上皮屏障，同時(shí)癌細(xì)胞分泌的PSA增多，致使更多的PSA直接進(jìn)入血液內(nèi)［2］。目前臨床用于前列腺癌診斷最廣泛的分子標(biāo)志物是PSA，在臨床上已將其作為前列腺癌一個(gè)重要的篩查指標(biāo)［3］。大多數(shù)前列腺癌病人血清PSA水平超過正常值，PSA提高了低分級(jí)、小病灶的早期發(fā)現(xiàn)與診斷。但它并不是一個(gè)特異性的腫瘤標(biāo)記物，當(dāng)其濃度在4～10μg／L時(shí)存在一定假陰性、假陽性的病例［4?5］。

3.2 A1在腫瘤中的作用 Bcl?2是細(xì)胞凋亡過程中的一類調(diào)節(jié)因子，此基因家族包含兩類功能相反的基因，一類是抑制細(xì)胞凋亡的基因Bcl?2、Bcl?XL、Bcl?w、Bfl?1、Brag?1、Mcl?1和A1等，另一類是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因Bax、Bak、Bok、Bcl?Xs、Bad、Bid、Bik、Blk和Hrk等。A1基因是造血細(xì)胞在粒?巨噬細(xì)胞集落刺激因子和脂多糖誘導(dǎo)下產(chǎn)生的早期反應(yīng)基因，與Bcl?2同源，均為抗凋亡基因，其編碼產(chǎn)物為20kD蛋白質(zhì)，在羧基C端與Bcl?2蛋白有40%的同源性。A1蛋白主要定位于線粒體外膜，通過C末端疏水性氨基酸直接影響線粒體膜功能，阻止細(xì)胞凋亡［6］。

3.3 本研究的意義 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A1蛋白的表達(dá)與前列腺癌細(xì)胞的增殖水平和PSA的濃度密切相關(guān)。隨著PSA濃度的增高，A1蛋白表達(dá)增高，抑制凋亡能力上升。特別當(dāng)PSA濃度在4～10μg／L時(shí)，難以鑒別診斷前列腺癌和前列腺增生時(shí)，將A1和PSA聯(lián)合檢測對(duì)前列腺癌進(jìn)行早期診斷，可明顯提高對(duì)前列腺癌診斷的準(zhǔn)確性，提高了前列腺癌診斷的靈敏度和特異性，減少病人不必要的活檢，為前列腺癌疾病診斷、治療預(yù)后觀察提供臨床價(jià)值。

［1］ 華立新，喬迪，宋寧宏，等.應(yīng)用前列腺特異抗原篩查診斷前列腺癌的臨床意義［J］.中華腫瘤雜志，2009，31（9）：705?709.

［2］ Parkin DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer JClin，2005，55（2）：74?108.

［3］ 趙旭宏，田野，靳勝，等.前列腺增生的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)分析［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30（3）：277?281.

［4］ Wolff JM，Borchers H，Effert PJ，et al.Free?to?total prostate specific antigen serum concentrations in patients with prostate cancer and benign prostatic hyperplasia［J］.Br J Um l，1996，78（3）：409?413.

［5］ 邱梁，邱雁，李江.血清前列腺特異抗原相關(guān)參數(shù)在前列腺偶發(fā)癌的臨床意義［J］.實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2013，27（8）：660?663.

［6］ Maianski NA，Geissler J，Srinivasula SM，etal.Functional char?acterization of mitochondria in neutrophils：a role restricted to apoptosis［J］.Cell Death Differ，2004，11（2）：143?153.

The clinical value of combined detection of A1 protein and prostate specific antigen in prostate cancer and prostatic hyperplasia

MA Zeng?huang．Huangshi Center for Clinical Laboratory，Huangshi435000，China

ObjectiveThis study aims to investigate the clinical value of combined detection of PSA and A1 to dif?ferentiate prostate cancer from bengin prostatic hyperplasia.M ethodsThe serum PSA levels were detected by electro chemiluminescence，The expression of A1 in the prostate cancer and benign prostatic hyperplasia was detected by RT?PCR and western?blotting.The relationship of expression of A1 protein with PSA was analyzed.ResultsThe expression of A1 protein in patients with prostate cancer was significantly lower than that in patients with benign prostatic hyperplasia and healthy persons（P＜0.01）.The expression of A1 protein was related with the concentration of PSA.ConclusionsA1 protein is correlated with themodulation of proliferation in the development of prostate cancer.The expression of A1 protein plays an important role in the development of prostate cancer.The combined detection of PSA and A1 protein is helpful in the diagnosis of prostate cancer.

prostate cancer；prostatic hyperplasia；prestate specific antigen；A1 protein

R 697.3

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.01.014

2013?05?27）

435000湖北省黃石市，黃石市臨床檢驗(yàn)中心