鄒成林 陳維鈞 孫曉順 方璟 涂軍 趙亞洲

促血小板生成素對(duì)大鼠腦缺血再灌注腦組織的保護(hù)作用

鄒成林 陳維鈞 孫曉順 方璟 涂軍 趙亞洲

目的探討促血小板生成素對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后的保護(hù)作用及機(jī)制。 方法 采用線栓法阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈血流制成局灶性腦缺血再灌注損傷模型。將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分成促血小板生成素（TPO）組、缺血再灌注組、假手術(shù)組和正常組。于缺血開始時(shí)TPO組給予TPO 5μg／kg腹腔注射；缺血再灌注組給予等劑量生理鹽水。分別于再灌注6、12、24、48 h后斷頭取腦、切片，進(jìn)行HE染色、Bcl?2免疫組化染色和細(xì)胞凋亡檢測。結(jié)果缺血再灌注后，TPO組和缺血再灌注組大鼠缺血側(cè)皮層可檢測到凋亡細(xì)胞，且TPO組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而假手術(shù)組及正常組未檢測到凋亡細(xì)胞；TPO組和缺血再灌注組缺血側(cè)皮層Bcl?2陽性細(xì)胞數(shù)均高于假手術(shù)組及正常組，與缺血再灌注組相比，TPO組Bcl?2蛋白表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論TPO可抑制缺血再灌注損傷后缺血側(cè)皮層的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過上調(diào)Bcl?2基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

促血小板生成素；缺血再灌注損傷；細(xì)胞凋亡；Bcl?2

腦缺血再灌注損傷是急性腦血管病病理生理改變的一個(gè)重要方面，有效減輕腦缺血再灌注損傷具有重要的臨床意義。促血小板生成素（TPO）是調(diào)節(jié)血小板和巨核細(xì)胞系最主要的造血生長因子［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，TPO不僅參與造血的調(diào)控，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)也具有保護(hù)作用，它們通過動(dòng)員骨髓的內(nèi)源性干細(xì)胞，或通過其抗凋亡作用，參與損傷神經(jīng)組織的修復(fù)，在不同種類的神經(jīng)損傷中發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)和保護(hù)功能。楊默等［2］于2005年首次證實(shí)神經(jīng)系統(tǒng)中存在TPO受體（C?mpl），能促經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞生長，對(duì)抗細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)觀察TPO對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血側(cè)皮層Bcl?2的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，探討TPO發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～290 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。10%水合氯醛、SABC試劑盒、DAB顯色劑（武漢博士德）；原位末端標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）檢測試劑盒（北京中杉公司），抗Bcl?2抗體、尼龍線直徑2.3 mm（日本伊東公司），Olympus實(shí)體顯微鏡、計(jì)算機(jī)圖像分析軟件，重組人血小板生成素注射液（沈陽三生制藥股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及分組：將大鼠隨機(jī)分為正常組（6只）、假手術(shù)組（6只）、缺血再灌注組（24只）、TPO組（24只），觀察點(diǎn)為再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h。采用Longa等［3］的大腦中動(dòng)脈線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。TPO組于再灌注開始時(shí)經(jīng)腹腔注射TPO 5μg／kg，缺血再灌注組注人等量生理鹽水，正常組及假手術(shù)組大鼠不進(jìn)行缺血再灌注處理。

1.2.2 免疫組化染色檢測Bcl?2蛋白表達(dá)：各組大鼠斷頭處死取腦組織，常規(guī)固定、石蠟包埋、切片，進(jìn)行SABC法免疫組化染色。胞漿有棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。每張切片在缺血區(qū)隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野（×400）中的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值為Bcl?2陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測：按照原位TUNEL試劑盒說明書操作。結(jié)果判定：細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)。每張切片在缺血區(qū)隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野（×400）中的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值為凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 缺血再灌注組缺血2 h再灌注24 h后，大鼠缺血側(cè)大腦半球明顯腫脹，TPO組缺血側(cè)大腦半球腫脹較輕。腦組織切片HE染色顯示：正常組及假手術(shù)組皮層無壞死細(xì)胞，神經(jīng)元數(shù)量多；缺血再灌注組皮層缺血中心神經(jīng)元數(shù)量稀疏，并可見大量變性及壞死的神經(jīng)細(xì)胞；TPO組神經(jīng)細(xì)胞變性壞死數(shù)量少，病變輕。

2.2 原位細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 缺血再灌注組缺血側(cè)可見較多的陽性細(xì)胞，假手術(shù)組偶見個(gè)別陽性細(xì)胞，正常組未見陽性細(xì)胞。TPO組缺血區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)目減少，與缺血再灌注組相比有顯著性差異（P＜0.05）。見表1。

表1 缺血再灌注組和TPO組凋亡細(xì)胞數(shù)比較（s，個(gè)／視野）

表1 缺血再灌注組和TPO組凋亡細(xì)胞數(shù)比較（s，個(gè)／視野）

注：與缺血再灌注組比較，?P＜0.05

組別樣本數(shù)（個(gè)）凋亡細(xì)胞數(shù)TPO組24 45.30±7.67?缺血再灌注組24 67.50±9.37

2.3 Bcl?2免疫組化染色結(jié)果 缺血再灌注組大鼠缺血周邊區(qū)可見較多陽性細(xì)胞表達(dá)，與正常組相比，有顯著性差異（P＜0.05）。缺血再灌注組及TPO組大鼠再灌注6h時(shí)Bcl?2表達(dá)增加，24 h達(dá)峰值，之后表達(dá)出現(xiàn)下降；與缺血再灌注組比較，TPO組各時(shí)間點(diǎn)Bcl?2陽性細(xì)胞均明顯增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 大鼠腦缺血再灌注損傷后各時(shí)間點(diǎn)Bcl?2陽性細(xì)胞數(shù)的比較（s，個(gè)／視野）

表2 大鼠腦缺血再灌注損傷后各時(shí)間點(diǎn)Bcl?2陽性細(xì)胞數(shù)的比較（s，個(gè)／視野）

注：與缺血再灌注組比較，?P＜0.05；與正常組比較，△P＜0.05

組別6 h 12 h 24 h 48 h TPO組50.25±6.59?△60.36±8.79?△78.70±9.79?△68.36±9.20?△缺血再灌注組35.68±5.89△42.25±6.68△55.40±9.39△50.40±8.39△假手術(shù)組12.40±2.85 13.40±3.83 14.40±4.75 13.40±3.76正常組11.40±1.93 12.40±3.85 13.40±5.55 12.40±2.26

3 討論

缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，包括缺血后損傷過程和再灌注后的損傷過程。腦缺血后神經(jīng)元死亡是一個(gè)極其復(fù)雜的病理過程。本實(shí)驗(yàn)中原位細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示缺血再灌注組及TPO組缺血側(cè)可見較多的陽性細(xì)胞，表明細(xì)胞凋亡參與缺血再灌注損傷過程。近年來許多學(xué)者從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等方面研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡參與腦缺血再灌注損傷。

TPO是一種造血正調(diào)控因子，可刺激巨核細(xì)胞增殖分化、成熟和血小板生成，TPO在腦缺血后腦保護(hù)中的作用機(jī)制目前尚不十分清楚。有研究認(rèn)為，TPO對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有促進(jìn)生長和抗凋亡的作用［4］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TPO組缺血腦組織HE染色神經(jīng)細(xì)胞變性壞死數(shù)量少，病變輕，同時(shí)缺血再灌注組缺血側(cè)可見較多的陽性細(xì)胞，TPO組缺血區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)目減少，與缺血再灌注組相比有顯著性差異（P＜0.05）。說明TPO能保護(hù)缺血神經(jīng)元。TPO是調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞增殖、分化、成熟和介導(dǎo)血小板生成的造血因子，它的生物學(xué)效應(yīng)由其受體C?Mpl介導(dǎo)，通過調(diào)節(jié)干細(xì)胞中AKT和STAT等蛋白的磷酸化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及凋亡［5］。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，TPO可以通過C?mpl受體介導(dǎo)激活內(nèi)皮細(xì)胞合成血小板激活因子并通過STAT信號(hào)通路誘導(dǎo)血管生成［6］。Perlingeiro等［7］在最近的研究中首次在成血管細(xì)胞中檢測到C?mpl的表達(dá)，TPO可支持成血管集落形成細(xì)胞的生長，促進(jìn)成血管細(xì)胞增殖，實(shí)驗(yàn)同時(shí)證實(shí)TPO能明顯減少缺血再灌注損傷誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。

本研究表明，缺血再灌注組Bcl?2陽性細(xì)胞表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TPO組在各時(shí)間點(diǎn)與缺血再灌注組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bcl?2是抑制凋亡的重要基因，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TPO組Bcl?2蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡數(shù)減少，提示TPO能減少大鼠腦缺血側(cè)大腦細(xì)胞凋亡，其減少細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能通過上調(diào)Bcl?2表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。Hong等［8］研究表明，腦缺血后上調(diào)Bcl?2表達(dá)的治療，可縮小梗死面積。其動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，缺血8 h之內(nèi)Bcl?2表達(dá)不明顯，之后隨著時(shí)間的延長，Bcl?2表達(dá)增高，24 h達(dá)到高峰，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。Plesnila等［9］研究證明，Bcl?2家族與腦缺血時(shí)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡有緊密關(guān)系，應(yīng)用干預(yù)因素可上調(diào)Bcl?2的表達(dá)，減小梗死面積。李虹等［10］研究也發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理使缺血腦組織Bcl?2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，抑制凋亡細(xì)胞產(chǎn)生。

綜上所述，給予TPO，可使大鼠腦缺血再灌注損傷區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，其保護(hù)作用可能是通過上調(diào)Bcl?2減少細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。但是由于腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞損傷受到多種基因的調(diào)控，TPO還可能通過調(diào)控其他基因及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮保護(hù)作用，這還待進(jìn)一步研究。

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Protective effects of thrombopoietin on cerebral ischem ia?reperfusion in rats

ZOU Cheng?lin，CHENWei?jun，SUN Xiao?shun，F(xiàn)ANG Jing，TU Jun，ZHAO Ya?zhou．Department of Internal Medicine，the Second People's Hospital of Jingzhou，Jingzhou 434000，China

ObjectiveTo study the protective effects and themechanism of thrombopoietin（TPO）on cerebral is?chemia?reperfusion in rats.M ethodsThread embolism was performed to establish cerebral ischemia?reperfusionmodel in rats.Sixty SD ratswere divided into TPO group，ischemia?reperfusion group，sham?operation group and normal group ran?dom ly.The TPO was given to TPO group at the beginning of ischemia at a dose of 5μg／kg；Ischemia?reperfusion group was given isodose physiological saline.6 h，12 h，24 h and 48 h after reperfusion，the ratswere executed and the brain tis?sues were cut into sections for HE staining and theimmunohistochemical staining to detect Bcl?2 and apoptosis.ResultsAfter ischemia?reperfusion，the apoptotic cellswere detected in TPO group and ischemia?reperfusion group in lateral cortex of rats，and the apoptosis cell number of TPO group was obviously less than thatof ischemia?reperfusion group（P＜0.05）. While no apoptotic cells were detected in sham?operation group and normal group.The number of Bcl?2 positive cells in TPO group and ischemia?reperfusion group was higher than that in control group and normal group.Expression of Bcl?2 pro?tein in TPO group was significantly higher than that in ischemia?reperfusion group（P＜0.05）.ConclusionsTPO can inhibit cell apoptosis of ischemia lateral cortex after ischemia?reperfusion injury，and themechanism may be through raising the expression of Bcl?2 genes.

thrombopoietin；ischemia?reperfusion injury；apoptosis；Bcl?2

R 973

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.01.013

2013?06?25）

434000湖北省荊州市，荊州市第二人民醫(yī)院內(nèi)一科