張蕾 李靜 戴偉宏 孟艷

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 230036)

蓖麻蠶(Samia cynthia ricini)是一種與家蠶親緣關(guān)系較近的野蠶，食性廣，但不吃桑葉。桑葉乳汁中含有大量DNJ、D－AB1等生物堿，對S.c.ricini等非食桑的昆蟲具有強烈的毒性，阻礙其生長以致死亡［1，2］。生物堿主要抑制昆蟲腸道的蔗糖水解酶的活性，從而達(dá)到阻礙昆蟲正常生長發(fā)育的毒性效果［3，4］。

β－呋喃果糖苷酶(β－ fructofuranosidase，β－FFase)是一種蔗糖水解酶，在植物和微生物中廣泛存在，家蠶BmSUC1是第一個被分子克隆和功能鑒定的動物β－FFase［5］。家蠶BmSuc1在家蠶幼蟲中腸的杯狀細(xì)胞大量表達(dá)，其編碼的酶蛋白具有典型的蔗糖水解酶功能，且?guī)缀醪皇?DNJ的抑制作用［4］。BmSUC1的發(fā)現(xiàn)和功能鑒定，對于解讀家蠶為何能夠巧妙地回避桑樹生物堿毒害作用的酶學(xué)適應(yīng)機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。作為家蠶的近緣物種，S.c.ricini不以桑葉為飼料，桑葉生物堿對其生長和發(fā)育具有較強的阻礙作用［5］，而我們發(fā)現(xiàn)S.c.ricini的基因組中同樣存在β－FFase同源基因，并已克隆獲得可拼接為全長cDNA的各個片段。Sc-Suc1和ScSuc2對于 S.c.ricini而言是否具有功能，其生物學(xué)意義如何，值得研究。

重疊延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR，簡稱SOE PCR)技術(shù)是采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來的技術(shù)［6］。該技術(shù)操作簡便，并且可以獲得內(nèi)切酶消化和連接酶處理的方法難以得到的產(chǎn)物［8］。如今SOE PCR已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究中的常用方法，應(yīng)用非常廣泛，如擴(kuò)增長片段DNA，基因定點誘變，構(gòu)建融合基因等［7，8］。

筆者利用SOE PCR的方法，對S.c.ricini的β－FFase基因 ScSuc1 和 ScSuc2 的 5＇末端、3＇末端以及中間片段分別進(jìn)行了擴(kuò)增和拼接，以期獲得S.c.riciniβ－FFase同源基因的完整開放閱讀框(open reading frame，ORF)，為將來進(jìn)行基因的體外表達(dá)及其功能研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

連接有ScSuc1和ScSuc2 cDNA各個片段的pGEM－T Easy重組載體為本實驗室前期所構(gòu)建。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金公司。DNA Marker、克隆載體pMD－19T試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒購自TAKARA公司。DNA純化回收試劑盒購自北京艾德來公司。瓊脂糖購自Invitrogen公司。氨芐青霉素(ampicillin)、LB培養(yǎng)基購自上海生工公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

為了拼接得到ScSuc1和ScSuc2全長ORF，我們根據(jù)實驗室前期克隆的ScSuc1－5’(上游片段)、ScSuc1－dgPCR(中間片段)、ScSuc1－3’(下游片段)和 ScSuc2－5’(上游片段)，ScSuc2－ dgPCR(中間片段)，ScSuc2－3’(下游片段)的序列，設(shè)計了6對PCR擴(kuò)增引物(表1)。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增目的

1.2.2 PCR 擴(kuò)增各模板 DNA 片段

以含有ScSuc1或ScSuc2cDNA各個片段的pGEM－TEasy重組質(zhì)粒DNA為模板，用表1所示的引物分別擴(kuò)增ScSuc1和ScSuc2的上游、中間和下游片段，使得拼接片段的重疊部分的堿基個數(shù)合適。50uLPCR反應(yīng)體系中包含5×PrimSTARBuffer 10uL，1.5UPrimSTARHSDNA聚合酶，0.2 ～0.5 μg模板 DNA，終濃度為10umol/L的dNTPMix和0.2umol上下游引物(F和R)，最后加 ddH2O補齊至50μL。PCR反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性5min后接30個循環(huán)，每個循環(huán)包括98℃變性10s、50℃退火10s和72℃延伸40s，循環(huán)結(jié)束后72℃反應(yīng)10min。

1.2.3 連接、轉(zhuǎn)化與測序

PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用DNA純化回收試劑盒回收目的片段。按TAKARA公司T－載體試劑盒說明書將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD－19T載體，然后用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用含100mg/LAmp的LB平板培養(yǎng)細(xì)胞，并篩選陽性克隆。挑取單菌落由Invitrogen公司測序，進(jìn)行序列確認(rèn)。

1.2.4 SOEPCR

獲得重疊部分堿基個數(shù)合適且序列無誤的各片段后，利用SOEPCR法將各片段進(jìn)行拼接。首先以上游和中間片段1:1混合作為模板進(jìn)行第一輪拼接，將拼接后得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后，按1.2.3所述方法進(jìn)行克隆和測序確認(rèn)，序列正確后再與下游片段混合作為模板，進(jìn)行第二輪拼接，最終得到完整的ORF。

SOEPCR的反應(yīng)體系為50μL，包含5×Prim-STARBuffer10uL，1.5UPrimSTARHSDNA 聚合酶，兩個模板 DNA 各 0.1 ～ 0.3μg，終濃度為10umol/L 的 dNTPMix和 0.2μmol上下游引物(F和R)，最后加ddH2O補齊至50μL。PCR反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性5min后接30個循環(huán)，每個循環(huán)包括98℃變性 10s、46℃退火(第一輪。第二輪為55℃)10s和72℃延伸1min，循環(huán)結(jié)束后72℃反應(yīng)10min。第二輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，再次按1.2.3所述方法對最終獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序，確認(rèn)基因全長ORF序列信息。

2 結(jié)果和分析

2.1 用于SOEPCR的DNA模板的擴(kuò)增

為了獲得SOEPCR拼接用的模板DNA，我們根據(jù)實驗室前期克隆所得到S.c.riciniβ－FFase同源基因ScSuc1和ScSuc2的cDNA序列設(shè)計了6對引物(表1)，以包含各個基因片段的pGEM－TEasy重組質(zhì)粒DNA為模板，用常規(guī)PCR的方法分別對每個基因的上游、中間和下游片段進(jìn)行了擴(kuò)增反應(yīng)。拼接前各個基因片段的預(yù)期大小如表2所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，所得片段長度與預(yù)期完全相符(圖1，圖2，泳道1～3)。對各片段進(jìn)行切膠回收，并與T載體連接測序，結(jié)果表明各片段的堿基序列正確，并且在上游片段(5’)末端、中間片段(dgPCR)前端以及中間片段末端、下游片段(3’)前端均有重疊個數(shù)合適的堿基。

表2 拼接前后各基因片段的預(yù)期大小(bp)

圖1 ScSuc1的擴(kuò)增和拼接

2.2 SOEPCR對基因ORF的拼接

如圖1所示的拼接流程，我們首先對ScSuc1的各片段進(jìn)行拼接。以ScSuc1上游和中間片段為混合模板，5’F和dgPCRR為上下游引物進(jìn)行第一輪拼接，預(yù)計拼接片段大小為868bp(表2)。SOE PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，所得片段長度與ScSuc15’－dgPCR的長度一致(圖1，泳道4)。經(jīng)切膠回收和克隆測序分析表明，堿基的序列及大小均無誤。然后以ScSuc15’－dgPCR和ScSuc1下游片段為混合模板，5’F和3’R為上下游引物進(jìn)行第二輪SOEPCR拼接，片段大小預(yù)期為1464bp(表2)。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，所得片段長度與ScSuc15’－3’長度一致(圖1，泳道5)。經(jīng)切膠回收和克隆測序分析表明，我們成功地獲得了ScSuc1的完整ORF。按照相同的方法和步驟，我們得到了ScSuc2的完整ORF全長片段。如圖2所示，泳道4為第一輪SOEPCR的拼接產(chǎn)物ScSuc25’－dgPCR，泳道5為第二輪拼接產(chǎn)物Sc-Suc25’－3’。

圖2 ScSuc2的擴(kuò)增和拼接

3 討論

蓖麻蠶為非食桑昆蟲，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)雖然在S.c.ricini的基因組中存在β－FFase同源基因ScSuc1和ScSuc2，但2個基因在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平都很低，難以通過反轉(zhuǎn)錄PCR的方法直接得到全長cDNA。本研究利用SOEPCR的方法，把前期得到的ScSuc1和ScSuc2的5＇端、中間片段以及3＇端各個cDNA片段成功拼接起來，分別獲得了兩個基因的完整ORF片段(圖1，圖2)，很好地解決了因轉(zhuǎn)錄水平低而帶來的直接克隆基因的困難，為類似問題提供方法借鑒。另外，本研究為今后開展基因的體外表達(dá)及研究S.c.ricini中β－FFase基因是否具有蔗糖水解酶的活性功能以及酶的活力特性分析等研究奠定了必要的實驗基礎(chǔ)。

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