黃佳欣 吳碧君 聶 琦 梁詩韻 胡滿根

(1.南昌大學(xué)食品學(xué)院；2.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031)

黃酮類物質(zhì)廣泛存在與自然界的天然產(chǎn)物，是許多中草藥的活性成分。研究表明黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗腫瘤、消炎抑菌、降血糖以及增強免疫力等生物學(xué)功效。傳統(tǒng)的分離方法如柱色譜法[2]和有機溶劑萃取法在許多領(lǐng)域已經(jīng)有了廣泛運用，但卻難以應(yīng)用于食品級黃酮類物質(zhì)的純化。原因在于大量的有機溶劑的使用會導(dǎo)致某些黃酮類物質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，從而降低其藥效甚至失效。另一方面，大量有機溶劑的使用還會造成有機溶劑殘留，從而使最終產(chǎn)品具有一定的生物毒性。因此急需研究和開發(fā)易于工業(yè)化的、高效的黃酮類物質(zhì)的分離純化方法。反膠束體系是近些年發(fā)展起來的一種高效的、適用于工業(yè)化生產(chǎn)的生物活性物質(zhì)分離純化技術(shù)。反膠束是表面活性劑分子在非極性有機溶劑中超過臨界濃度而自發(fā)形成的具有熱力學(xué)穩(wěn)定性的納米級聚集體，其親水性的極性腔的性質(zhì)接近于細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，從而保護(hù)生物活性物質(zhì)的性質(zhì)不發(fā)生改變[5]。該方法已廣泛適用于蛋白質(zhì)、酶、生物堿等生物活性物質(zhì)的分離，并取得較好的結(jié)果。

本文以蘆丁為黃酮類物質(zhì)的代表，對反膠束體系分離黃酮類物質(zhì)的條件進(jìn)行了前期探索。考察了表面活性劑和溶劑種類對萃取效果的影響，建立了以十六烷基三甲基溴化銨為表面活性劑，正己烷為溶劑的反膠束正向萃取體系。詳細(xì)考察了助溶劑的用量、表明活性劑的用量及振蕩時間對蘆丁正萃的影響。確定了蘆丁正向萃取的最佳條件。

1.實驗部分

1.1 儀器與試劑

SP-723型可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，TGL-16C高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，康氏振蕩器(江蘇省金壇市榮華儀器有限公司)；KQ2200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，AL104電子分析天平(METTLER TOLEDO)。

蘆丁、CTAB、十二烷基磺酸鈉(SDS)、大豆卵磷脂(HLB)、聚氧乙烯月桂醚(BRJ35)、正辛烷、異辛烷、正己烷、正庚烷、環(huán)己烷、正己醇均為分析純(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

蘆丁溶液：精密稱取一定量的蘆丁加入到100ml的70%乙醇中，超聲使其充分溶解，得到濃度即為蘆丁溶液，臨用現(xiàn)配。

1.2 實驗方法

1.2.1 正向萃取實驗

對照品溶液的制備：將一定比例的反膠束溶液和蘆丁溶液加入具塞25ml錐形瓶了，100rpm振蕩混合一段時間，4000rpm離心5min，分相。測定下層溶液中蘆丁的濃度。

1.2.2 蘆丁濃度的測定

對照品溶液的制備：精密稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品100mg，置100mL量瓶中，加乙醇70mL，置水浴上微熱使溶解，放冷，加水至刻度，搖勻。準(zhǔn)確吸取10mL，置100mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得(每1mL中含無水蘆丁0.1mg)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取對照品溶液(0.1mg/ml)0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，分別置于10mL量瓶中，各加30%乙醇使成5.0mL，各精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，充分搖勻，放置6分鐘。各精密加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，充分搖勻，放置6分鐘。各加1lmol/L氫氧化鈉溶液4.0mL，用蒸餾水稀釋至刻度，充分搖勻，放置15分鐘，用分光光度計，在510nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取一定量的下層溶液，測定蘆丁的濃度，計算蘆丁正向萃取率。

萃取率(%)=(初始蘆丁的量-下層溶液中蘆丁的量)/初始蘆丁的量×100%

2.結(jié)果與討論

2.1 表面活性劑的種類對蘆丁萃取率的影響

不同的表面活性劑的表面張力不同，在相同溶劑中形成的反膠束的極性腔大小不同，從而導(dǎo)致萃取效果大不相同。因此，我們首先對表明活性劑的種類進(jìn)行了篩選。選取了常用的HLB、CTAB、SDS、BRJ35這四種表面活性劑進(jìn)行對比試驗。結(jié)果表明，利用SDS和BRJ35構(gòu)建的反膠束體系，離心后有大量的沉淀，可能是這兩種表明活性劑誘導(dǎo)蘆丁變性，導(dǎo)致其沉淀，使得萃取率虛高。蘆丁是帶負(fù)電的化合物，因此陽離子表明活性劑CTAB和兩性表明活性劑HLB對其都有較好的萃取效果，且CTAB的萃取效果明顯要高于HLB。因此我們選擇以CTAB作為表面活性劑構(gòu)建反膠束體系萃取蘆丁。

圖1 表面活性劑種類的影響

2.2 溶劑的種類對蘆丁萃取率的影響

不同的有機溶劑會導(dǎo)致表明活性劑的離子強度不同，從而會影響蘆丁進(jìn)入表面活性劑極性部位的速率及總量。因此，我們考察了正辛烷、異辛烷、正己烷、正庚烷、環(huán)己烷這五種溶劑對正向萃取蘆丁的影響。如圖2所示，當(dāng)以正己烷作為有機溶劑構(gòu)建反膠束體系的時候，萃取率最高。

圖2 溶劑種類的影響

2.3 表面活性劑的量對蛋白萃取率的影響

表明活性劑總量的增加使得表面活性劑的聚集數(shù)增加和反膠束的尺寸增加，有利于目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)入反膠束的極性腔中。因此，我們在0.02-0.08g/ml的范圍內(nèi)考察了表明活性劑的影響，結(jié)果表明當(dāng)CTAB的濃度為0.08g/ml的時候，正向萃取率最高。再增加表明活性劑的用量時，離心后，水相會有大量殘留的白色物質(zhì)(未溶解的CTAB)，對后續(xù)測量有很大的干擾[3]。且也不利于以后工業(yè)化的放大生產(chǎn)，因此我們選擇0.08g/ml為最佳條件。

圖3 表面活性劑的量的影響

2.4 正己醇對蘆丁萃取率的影響

CTAB是單鏈的表面活性劑，與雙鏈的表面活性劑相比較，其非極性部位更少，往往需要加入正己醇作為助溶劑進(jìn)行實驗[1]。但是本實驗發(fā)現(xiàn)加入正己醇反而會導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)萃取率的降低。因此，我們選擇沒有助溶劑的反膠束體系進(jìn)行實驗。

圖4 正己醇的影響

2.5 振蕩時間對蘆丁萃取率的影響

振蕩可以強化擴散，使反膠束良好的分散充分，從而促進(jìn)液態(tài)反應(yīng)物通過固體產(chǎn)物層的有效擴散，增大相界面積和擴散系數(shù)[4]。分別考察了振蕩時間為3min、5min、7min、9min、11min時，CTAB-已烷反膠束體系對蘆丁萃取的影響。結(jié)果表明當(dāng)振蕩時間過短或者過長時，離心后的溶液中均會有沉淀存在。當(dāng)振蕩時間在7-9min時，溶液中不存在沉淀。通過計算蘆丁的萃取量，確定7min為最佳振蕩時間。

3.結(jié)論

由實驗結(jié)果可知，CTAB-已烷反膠束體系在一定條件下能夠有效的正向萃取黃酮類化合物。表明活性劑的種類和振蕩時間在保證黃酮類物質(zhì)的活性中起著關(guān)鍵性的作用。在最佳反應(yīng)條件下，蘆丁的正向萃取率可達(dá)90%以上。本研究結(jié)果為后續(xù)的反向萃取研究奠定了一定的研究基礎(chǔ)。

[1]庹潯，陳櫻一，柳暢先.CTAB-己醇-辛烷體系分離純化醇脫氫酶的反萃研究[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2008，20(6)：675-677.

[2]董彩軍，李鋒.黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，(2010)02-0065-05.

[3]劉薇，袁興中.不同反膠束體系萃取纖維素酶的條件優(yōu)化對比研究[J].中國環(huán)境科學(xué)，(2013)04-0728-06.

[4]陳復(fù)生，程小麗.反膠束萃取大豆蛋白過程中動力學(xué)的研究[J].中國糧油學(xué)報2010.25(5).

[5]趙曉燕，陳復(fù)生，薛文通.不同反膠束體系提取大豆蛋白質(zhì)的研究[J].