張廷君，周仲輝，曾 躍，劉鳳君，王貴霞，林家福

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科，四川 南充 637000)

鉤端螺旋體病是由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)所致的急性動物源性傳染病，該病在全世界范圍內(nèi)流行，我國大部分省、市、自治區(qū)均有本病的報道[1]。然而，鉤體病的發(fā)病機制至今仍未被闡明，隨著對該病的深入研究，細(xì)胞因子在鉤體致病過程中的作用越來越受到各地研究者們的重視，體外研究[2-3]發(fā)現(xiàn)鉤端螺旋體可以促進人體外周血細(xì)胞分泌一些細(xì)胞因子，其中IFN-γ、TNF-α、IL-10三種因子均有大量表達。而另有學(xué)者從鉤體病患者血清中也檢測到這幾種細(xì)胞因子的升高[4]，但目前為止，動態(tài)連續(xù)觀察研究鉤體病患者血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10細(xì)胞因子的報道甚少。本研究的目的在于了解鉤體病人血清中細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-10在該病的敗血癥期、器官損傷期及恢復(fù)期的變化規(guī)律，證實細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-10在鉤體清除及致病過程中的作用，為臨床及科研提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清標(biāo)本 31例臨床診斷鉤體病患者標(biāo)本均于2011年取自南充市儀隴縣各醫(yī)院及川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，根據(jù)采取患者血清標(biāo)本時患者所處的臨床分期即鉤體敗血癥期、器官損傷器、恢復(fù)期，將相應(yīng)標(biāo)本分為早期、中期、晚期三組：起病后3 d內(nèi)為早期，起病后3～10 d或生化檢查表明處于器官損傷期的為中期，好轉(zhuǎn)出院(并且病程大于10 d)時采集的最后一次血為晚期標(biāo)本[1]。對照標(biāo)本共10例，男性5例，女性5例，平均年齡(48.20±10.39)歲，均為鉤體病流行地區(qū)健康體檢者靜脈血血清。

1.1.2 主要試劑 無菌兔血清及鉤體標(biāo)準(zhǔn)株購自四川省疾控中心，EMJH培養(yǎng)基購自BD公司，鉤體基因組DNA提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司，2*Taq PCR MasterMix購自TIANGEN BIOTECH公司，人IFN-γ、TNF-α、IL-10酶聯(lián)免疫試劑盒購自成都微克生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1確立診斷 對31例臨床診斷的患者的血清分別用血清顯微凝集試驗(MAT)(委托四川省疾控中心檢測)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、鉤體分離培養(yǎng)三種方法進行檢測，據(jù)鉤端螺旋體病診療指南，三種檢測方法任一陽性均可以確定為實驗室診斷患者。

1.2.2檢測細(xì)胞因子 采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ABC-ELISA)檢測血清IFN-γ、TNF-α、IL-10濃度(分別采用人IFN-γ、TNF-α、IL-10酶聯(lián)免疫試劑盒)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

對所有實驗數(shù)據(jù)首先進行正態(tài)性檢驗，然后用SPSS v16.0統(tǒng)計軟件處理，各期病例組與正常人的比較用一維方差分析Dunnett檢驗，各病例組之間兩兩比較用雙因素重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗室診斷病例結(jié)果

鉤體分離培養(yǎng)、MAT、PCR檢測確定為實驗室診斷病例24例，其中MAT法確診2例，PCR法確診24例，分離培養(yǎng)確診0例，其中MAT法和PCR法均陽性2例；男性12例，女性12例。

2.2 患者各期血清及正常對照血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10的均值(表1)

表1 早、中、晚期血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10水平均數(shù)

*P<0.05，與早期組比較；#P<0.05，與中期組比較；△P<0.05，與晚期組比較。

因部分患者入院時已經(jīng)處于病程中期，故早期標(biāo)本數(shù)較中期少；部分患者未好轉(zhuǎn)則自動離院，故晚期標(biāo)本數(shù)較中期少。

2.3 各期血清IFN-γ水平比較

早期、中期患者血清中IFN-γ一直處于較高的水平，到晚期略有下降，但三組血清IFN-γ均明顯高于對照組(P<0.05)；兩兩比較早、中、晚期三組血清IFN-γ水平無差別(P>0.05)。

2.4 各期血清TNF-α水平比較

各期患者血清與對照組比較：早、中期TNF-α水平明顯高于正常人(P<0.05)，晚期血清TNF-α水平與正常人無差別(P>0.05)。病人早期血清中可檢測到較高水平的TNF-α，到中期達最高，晚期明顯降低。三期兩兩比較結(jié)果顯示：中期TNF-α水平明顯高于早期和晚期(P<0.05)，早期與晚期無明顯差異(P>0.05)。

2.5 各期血清中IL-10水平比較

各期患者血清與對照組比較顯示：病例組血清中的IL-10均較正常人高，(P<0.01)?；颊呷谘逯蠭L-10水平由早期到晚期逐漸下降，兩兩比較結(jié)果顯示差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

本研究中所取臨床診斷的31例標(biāo)本中，實驗室確診24例，其中MAT法確診2例，PCR法確診24例，分離培養(yǎng)確診0例，其中MAT法和PCR法均陽性2例。PCR法檢測陽性率最高，血液分離培養(yǎng)陽性率最低，其可能的原因為：其一，接種時只取兩滴血液，血液中的活菌太少；其二，血液中的血漿，膠質(zhì)，蛋白質(zhì)等成分影響了觀察效果。從檢測陽性率的角度看，本實驗中PCR法陽性率最高，其快速、易操作、經(jīng)濟等優(yōu)點均有利于該方法的推廣。盡管分離培養(yǎng)法陽性率低，但是該方法能培養(yǎng)出病原菌，豐富病原庫的作用是其他任何一種檢測方法都無法取代的。本研究采用了三種方法檢測臨床診斷的病例進行病原學(xué)診斷，一定程度上提高了診斷的陽性率。

細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-10所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)及其在免疫反應(yīng)中引起的瀑布效應(yīng)在機體清除病原體和造成機體損傷過程中起著至關(guān)重要的作用，本實驗通過檢測24例實驗室確診患者早、中、晚三期血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種因子呈現(xiàn)出各自的變化規(guī)律。

IFN-γ也叫免疫干擾素，具有較強的調(diào)節(jié)免疫和抗細(xì)胞增殖作用[5]，在細(xì)胞免疫清除病原體的過程中起著重要的作用。Vernel-Pauillac等關(guān)于鉤體的體外研究表明[2,4]致病性鉤體可以激活外周血中T淋巴細(xì)胞，并產(chǎn)生相關(guān)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ。時曼華等通過動物實驗研究推測鉤體的清除可能和其他細(xì)胞內(nèi)感染細(xì)菌的清除一樣與細(xì)胞免疫有關(guān)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)在鉤體病患者早期、中期晚期血清中的IFN-γ水平均明顯高于對照組。表明在整個病程中細(xì)胞免疫處于持續(xù)活躍狀態(tài)。四川省研究者對大量鉤體病患者進行長時間觀察發(fā)現(xiàn)恢復(fù)期的病人仍然可以長時間的排出鉤體[7]，提示雖然患者的癥狀緩解，病情恢復(fù)，但體內(nèi)的鉤體并沒有完全清除，這可能也是到了疾病的晚期，血清中的IFN-γ水平依然處于高水平的原因。IFN-γ在鉤體病患者血清中明顯升高且隨著病程的進展所表現(xiàn)的規(guī)律，提示IFN-γ在鉤體的清除及病情的進展中有重要的意義，其具體的作用機制還需要進一步探索。

TNF-α是免疫反應(yīng)中重要的促炎性細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)活性，它在全身炎癥反應(yīng)及早期器官損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵至關(guān)重要的作用[8]。既往研究[3]發(fā)現(xiàn)鉤體的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和糖脂蛋白(glycolipoprotein,GLP)能刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生過量的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)。Chierakul通過動物實驗[9]發(fā)現(xiàn)倉鼠被鉤體感染后最早升高的促炎細(xì)胞因子是TNF-α，Tajiki等[10]報道16例鉤體病患者中4例出現(xiàn)器官損害者血清TNF-α水平明顯升高。本組實驗監(jiān)測的鉤體病患者早期血清中的TNF-α水平較對照組明顯升高，中期的TNF-α水平較早期的高，到恢復(fù)期則與正常人的水平無明顯差異，與上述研究結(jié)果一致?？赡苁且驗楫?dāng)鉤體進入人體并刺激人體產(chǎn)生高水平的TNF-α，人體通過TNF-α調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)清除病原體；同時，TNF-α引起的炎癥反應(yīng)也導(dǎo)致了人體組織、器官的損傷，從而引發(fā)各種臨床表現(xiàn)。在恢復(fù)期，TNF-α恢復(fù)到正常水平，炎癥反應(yīng)停止，各器官功能也恢復(fù)正常。提示TNF-α在鉤體致病的過程中起著重要的作用，而且，在鉤端螺旋體病發(fā)生發(fā)展過程中，TNF-α水平的高低可能與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。

IL-10是一種有效的抗炎性物質(zhì)[11]，具有較強的抗炎癥能力，抑制細(xì)胞免疫，介導(dǎo)體液免疫并消滅病原體[12]。Diament等[13]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)鉤體的糖脂蛋白能引起IL-10水平升高。Marinho等[14]研究發(fā)現(xiàn)感染鉤體的倉鼠體內(nèi)的IL-10水平較對照組明顯升高。本實驗通過檢測不同時期臨床標(biāo)本發(fā)現(xiàn)鉤體病患者早期血清中IL-10處于較較高的水平，隨著病情的進展，中晚期血清中的IL-10水平有逐漸下降的趨勢，但晚期IL-10水平仍然明顯高于正常人。可能是因為在鉤體病的病程早期，機體內(nèi)的鉤體數(shù)量最多，由于機體的免疫反應(yīng)及使用抗生素消滅鉤體，到晚期大部分患者體內(nèi)鉤體被清除，但體內(nèi)仍可能殘留有鉤體。四川省研究者對97例鉤體病人進行臨床觀察發(fā)現(xiàn)在病程的晚期，仍然有14.43%鉤體病患者能夠長時間的排出鉤體[8]，這提示IL-10及其介導(dǎo)的體液免疫在鉤體的清除中起著重要作用，可能在恢復(fù)期體液免疫占主要地位。

總之，本研究通過三種不同的檢測方法檢測臨床診斷的鉤體病患者，以取得實驗室確診依據(jù)，證實了PCR法陽性率最高，值得臨床推廣；通過動態(tài)研究鉤體病患者血清中代表細(xì)胞免疫的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、促炎性細(xì)胞因子TNF-α及代表體液免疫的Th2細(xì)胞因子IL-10在病程中的變化規(guī)律，從臨床的角度證實了IFN-γ、IL-10和TNF-α可能在機體清除鉤體及疾病的發(fā)展過程中均起著重要的作用，其具體的作用機制尚需進一步研究。

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