楊慧敏，蹇順海，黃一凡，李祖茂

(川北醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病理學教研室，四川 南充 637000)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是以中樞神經系統(tǒng)白質炎性脫髓鞘病變?yōu)橹饕攸c的自身免疫性疾病，具有較高的致殘率。近幾年的研究提出了自身免疫、病毒感染、遺傳傾向等綜合作用的多因素病因學說，但其病因和發(fā)病機制至今仍未完全明確。目前多采用敏感動物制作與MS發(fā)病極為相似的疾病模型即實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型對MS進行研究。有國外研究者[1]在EAE疾病進展中觀察到血管生成現象，且與臨床表現保持平行，但其與髓鞘炎性破壞的具體關系目前尚未見相關研究。本研究擬通過復制大鼠EAE模型，觀察與血管生成有重要關系的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達，探討其與EAE發(fā)生發(fā)展的關系及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 健康雌性Wistar大鼠30只，體重180～220 g，隨機分組為模型組20只及對照組10只；豚鼠1只，體重350 g，均由川北醫(yī)學院動物實驗中心提供。

1.1.2 主要試劑 卡介苗凍干粉、百日咳菌液購自中國藥品生物制品檢定所，羊毛脂、液體石蠟購自南充藥業(yè)集團；固藍(luxol fast blue,LFB)購自SIGMA公司；大鼠VEGF、IL-4、IL-10及IFN-γ ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司，大鼠髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)ELISA試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作 羊毛脂20 g加入液體石蠟40 mL混勻，滅菌后每毫升加入卡介苗4～10 mg混勻即成完全弗氏佐劑，將豚鼠全腦及脊髓制成50%腦脊髓勻漿，與完全弗氏佐劑1∶1充分混勻即得到完全抗原。模型組20只，麻醉消毒后于四肢足墊內注射完全抗原0.4 mL/只，同時腹部皮內注射百日咳菌液0.1 mL(約含活菌3×109)，對照組10只，麻醉消毒后僅足墊注射等量生理鹽水。

1.2.2 模型判定 每日稱重，并參照Hooper等[2]的方法進行評分：0分：不發(fā)?。?分：豎毛，尾無力；2分：尾癱；3分：尾癱及后肢無力；4分：尾癱及不完全后肢癱；5分：完全后肢癱；6分：四肢癱；7分：瀕死或死亡。

1.2.3 取材 將模型組大鼠于發(fā)病高峰時(癥狀連續(xù)3 d無加重或評分6～7分時)處死，對照組大鼠于模型組全部處死同時處死。深度麻醉后，抽取右心房血液備用，用小號靜脈留置針經左心室穿刺，再用生理鹽水推注沖洗及4%多聚甲醛灌注固定后取全腦、脊髓。

1.2.4 病理學觀察 分離的大鼠全腦及脊髓用4%多聚甲醛固定24～48 h后行石蠟包埋切片及HE、LFB染色。

1.2.5 用ELISA檢測各因子在各組大鼠血清中的濃度 大鼠血液在促凝管中靜置30 min，3 000 r/min離心10 min分離血清，按試劑盒說明書用ELISA法檢測血清中VEGF、IL-4、IL-10、IFN-γ及MBP濃度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 EAE發(fā)病情況及病理學觀察

2.1.1 發(fā)病情況 全部模型組大鼠于免疫后(13.33±1.88) d開始出現癥狀，發(fā)病率為100%。具體表現為進食及活動減少，體重下降，進而尾部無力、后肢無力、大小便失禁、前肢無力等，觀察期間未出現死亡者。模型組發(fā)病高峰臨床評分為(4.4±1.35)分。對照組進食、活動情況良好，體重無減輕，無一發(fā)病。

2.1.2 病理學觀察 (1)HE染色：EAE主要的光鏡下形態(tài)學表現為炎癥性改變，主要表現為腦脊髓炎性水腫，血管擴張充血，以淋巴細胞為主的炎細胞浸潤。實驗組于發(fā)病高峰期取材、染色后觀察發(fā)現，大鼠的大腦、小腦及脊髓中有大量炎細胞浸潤，并可圍繞血管呈“血管袖套樣”改變，以脊髓及小腦病變最為明顯，主要集中于脊髓表面蛛網膜下腔及近表面的白質內，炎細胞浸潤明顯區(qū)由于水腫，組織間隙增寬。對照組大鼠中樞神經系統(tǒng)未見明顯改變(圖1)。(2)LFB染色：LFB可將正常髓鞘染成藍色，EAE病理改變?yōu)檠仔运枨拭撌?，故脫髓鞘區(qū)不被LFB染色或只見髓鞘碎片。模型組大鼠發(fā)病高峰時中樞神經系統(tǒng)在炎細胞浸潤明顯區(qū)可見明顯髓鞘脫失，呈空泡狀改變，病變較輕區(qū)域可見髓鞘碎片(圖2)。對照組大鼠中樞神經系統(tǒng)未見明顯脫髓鞘病變。

2.2 大鼠血清中各細胞因子表達檢測

模型組大鼠發(fā)病高峰時血清中VEGF、IFN-γ及MBP水平較對照組明顯升高，IL-4水平較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組血清IL-10水平與對照組相比較，差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 大鼠血清中各細胞因子表達情況及組間比較

VEGFIFN-γIL-4IL-10MBP模型組29.98±14.8420.71±12.3482.88±38.4211.53±8.5422.47±13.34對照組19.70±10.447.91±4.48144.91±30.155.24±1.154.69±2.65P值0.0430.0220.0190.2320.000t值2.1232.241-2.6161.2434.715

2.3 相關性分析

模型組大鼠中，臨床癥狀評分與VEGF水平呈顯著正相關(P<0.01)，與IFN-γ及MBP水平亦呈正相關，與IL-4水平呈負相關，相關性存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，與IL-10水平無明顯相關性(表2)。模型組大鼠血清中VEGF水平與IFN-γ及MBP水平呈正相關，與IL-4水平呈負相關，相關性存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，與IL-10水平無明顯相關性(表3)。

表2 模型組臨床評分與各細胞因子表達的相關性

表3 模型組VEGF與其余各細胞因子表達的相關性

3 討論

MS的確切發(fā)病機制仍不十分清楚，目前多認為是T淋巴細胞介導的炎性反應，細胞因子在其中起著重要作用。研究表明，MS患者中存在Thl/Th2類細胞因子的失衡，Th1細胞主要分泌促炎癥性細胞因子(如IL-2、IL-12、IL-17、IFN-γ、TNF-α等)，可激活巨噬細胞，介導遲發(fā)性變態(tài)反應誘發(fā)EAE；Th2細胞主要分泌抑炎癥性細胞因子(如IL-4、IL-5、IL-10、IL-6等)，可促進B細胞分化成熟，產生抗體，增強抗體介導的免疫應答，抑制或逆轉EAE的發(fā)生。細胞因子在EAE發(fā)病及病情進展中起著重要而復雜的調節(jié)作用[3-5]。

EAE作為MS經典動物模型，其病理改變與MS相似[6]，主要是腦和脊髓實質內小血管周圍和蛛網膜下腔內有大量淋巴細胞浸潤。淋巴細胞在血管周圍形成典型的袖套狀改變，病變部位髓鞘崩解、脫失，神經細胞變性、壞死，上述改變亦可以在我們的實驗中觀察到。研究發(fā)現[7-8]，EAE急性損害還包括血腦屏障(blood brain barrier，BBB)分解和病灶內毛細血管內皮細胞上黏附分子上調，提示血管通透性改變和內皮細胞的活化是MS發(fā)病機制中的重要部分。Th1細胞因子在其發(fā)病中的作用可能是通過上調病灶內毛細血管內皮細胞上黏附分子，使活化的T細胞得以穿過BBB進入腦實質中[9]，另外Th1細胞因子還可誘導基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)表達，促進BBB破壞和繼發(fā)腦組織損傷。

VEGF具有促進新生血管生成、增加血管通透性和促進單核細胞游走等功能[10]。而局部組織的缺血和缺氧可誘導VEGF的產生，與其相應的受體結合，激活內皮細胞，促進內皮細胞的增殖和遷移、基底膜的降解及表達某些整合素。研究者發(fā)現，血清VEGF水平在MS患者急性復發(fā)期較健康對照組或MS緩解期有所增加[11]；Proescholdt等[7]研究發(fā)現，MS脫髓鞘損害中VEGF表達有顯著增高，且病灶內血管數目增高與臨床及病理表現(即炎癥細胞浸潤和脫髓鞘)進展保持平行。

在本研究中，我們成功復制了大鼠EAE模型，模型組大鼠均不同程度出現由尾部開始的運動功能障礙癥狀。大多數EAE研究采用Kono’s 5分法[12]進行癥狀評分，但5分的分類相對粗略而不利于統(tǒng)計學分析，為了對癥狀的觀察和評價更加敏感和精細，我們采用Hooper’s改良后的7分法作為EAE神經功能損傷評分法，模型組發(fā)病高峰臨床評分為(4.4±1.35)分。因欲觀察EAE大鼠癥狀最明顯時病理表現與細胞因子表達的關系，我們在發(fā)病高峰時獲取大鼠的組織及血清檢材。

在我們的研究中發(fā)現，VEGF在EAE大鼠血清中表達較對照組有明顯增高，且與動物模型發(fā)病臨床評分呈顯著正相關，提示VEGF的增高很可能與EAE病變的進展有關；同時，VEGF與血清IFN-γ及MBP水平升高相一致(前者表示促炎因子的水平，后者可表示髓鞘損傷的程度)，與IL-4水平(可表示抑炎因子的水平)升高呈負相關，相關性檢驗具有統(tǒng)計學意義。與對照組相比，IL-4水平在模型組中顯著下降，IFN-γ水平顯著增高；IFN-γ在模型組大鼠血清中的水平與其臨床評分呈正相關，IL-4水平與臨床評分呈負相關，均具有統(tǒng)計學意義，與前人研究結果相符[3]。

綜合上述發(fā)現，我們認為，EAE時血清中增高的VEGF可以是炎癥區(qū)的血管內皮細胞釋放及巨噬細胞產生[13]，在其病變進展中，VEGF可能通過活化炎區(qū)的血管內皮細胞產生作用：(1)誘導活化的血管內皮細胞分泌MMPs，降解細胞外基質，促進炎細胞浸潤；(2)使血管通透性增高，局部趨化浸潤的炎細胞增多，釋放促炎因子，一方面直接參與炎癥過程，另一方面使血管內皮細胞上黏附分子表達上調而促進炎細胞浸潤，進一步破壞BBB；(3)誘導炎區(qū)新生血管形成，新生血管的內皮細胞不成熟，基底膜不完整，通透性大，炎細胞易于通過而進入病區(qū)。VEGF通過上述可能的機制與炎細胞釋放的細胞因子及調高的MMPs共同作用或誘導新生血管形成，致BBB免疫屏障受損，炎細胞到達CNS白質參與炎癥反應，導致髓鞘破壞。這可能為MS的治療打開新的思路，即抑制VEGF，使與之相關的炎癥促進因素得到控制，從而減輕炎癥破壞。

當然，MS及其模型EAE的發(fā)病機制目前認識不足，VEGF與之病變進展的研究也才剛開始，對于其中的確切聯系及抑制VEGF對MS及EAE是否有效還有待進一步研究。

【參考文獻】

[1]Kirk SL,Karlik SJ.VEGF and vascular changes in chronic neuroinflammation[J].J Autoimmun,2003,21(4):353-363.

[2]Hooper DC,Spitsin S,Kean RB,et al.Uric acid,a natural scavenger of peroxynitrite,in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(2):675-680.

[3]Amedei A,Prisco D,D’Elios MM.Multiple sclerosis:the role of cytokines in pathogenesis and in therapies[J].Int J Mol Sci,2012,13(10):13438-13460.

[4]Hamann I,Zipp F,Infante-Duarte C.Therapeutic targeting of chemokine signaling in Multiple Sclerosis[J].J Neurol Sci,2008,274(1-2):31-38.

[5]Comabella M,Khoury SJ.Immunopathogenesis of multiple sclerosis[J].Clin Immunol,2012,142(1):2-8.

[6]朱振國，王新施，陳艷艷，等.3種大鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的差異[J].醫(yī)學研究雜志，2013,42(2):34-37.

[7]Proescholdt MA,Jacobson S,Tresser N,et al.Vascular endothelial growth factor is expressed in multiple sclerosis plaques and can induce inflammatory lesions in experimental allergic encephalomyelitis rats[J].J Neuropathol Exp Neurol,2002,61(10):914-925.

[8]Argaw AT,Asp L,Zhang J,et al.Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease[J].J Clin Invest,2012,122(7):2454-2468.

[9]O’Connor RA,Prendergast CT,Sabatos CA,et al.Cutting edge:Th1 cells facilitate the entry of Th17 cells to the central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol,2008,181(6):3750-3754.

[10]Carvalho JF,Blank M,Shoenfeld Y.Vascular endothelial growth factor(VEGF)in autoimmune diseases[J].J Clin Immunol,2007,27(3):246-256.

[11]Su JJ,Osoegawa M,Matsuoka T,et al.Upregulation of vascular growth factors in multiple sclerosis:correlation with MRI findings[J].J Neurol Sci,2006,243(1):21-30.

[12]Urban JL,Kumar V,Kono DH,et al.Restricted use of T cell receptor V genes in murine autoimmune encephalomyelitis raises possibilities for antibody therapy[J].Cell,1988,54(4):577-592.

[13]Jeon SH,Chae BC,Kim HA,et al.Mechanisms underlying TGF-beta 1-induced expression of VEGF and Flk-1 in mouse macrophages and their implications for angiogenesis[J].J Leukoc Biol,2007,81(2):557-566.