朱柏貴， 張?zhí)K江， 李建勇，高鴻敏

FLT3基因突變對(duì)急性髓系白血病的影響

朱柏貴1， 張?zhí)K江2， 李建勇2，高鴻敏3

目的探討FMS樣酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosie kinase3,FLT3)基因突變對(duì)急性髓細(xì)胞樣白血病(acute myeloid leukemia,AML)的影響。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)結(jié)合直接測(cè)序和克隆測(cè)序?qū)?0例初診AML患者FLT3突變進(jìn)行研究，并結(jié)合臨床資料進(jìn)一步分析。結(jié)果正常核型AML患者FLT3基因內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(internal tandem duplication,ITD)陽(yáng)性檢出率20%，高于異常核型(6.25%)；與野生組相比，F(xiàn)LT3-ITD(+)突變患者初診時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白及骨髓原始細(xì)胞比例均高，緩解率低。結(jié)論FLT3突變是正常核型AML患者的主要分子標(biāo)志，其對(duì)疾病預(yù)后及靶向治療具有重要意義。

FMS樣酪氨酸激酶3；急性髓系白血??；基因突變

急性白血病患者的染色體核型分析為疾病治療反應(yīng)和生存預(yù)后提供了非常重要的生物學(xué)信息。近年來(lái)，學(xué)者指出多種分子標(biāo)記物與疾病具有顯著的預(yù)后相關(guān)性，并有利于急性白血病更加精細(xì)的分類和預(yù)后評(píng)估。FMS樣酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosie kinase3,FLT3)基因內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(internal tandem duplication, ITD)是AML患者中發(fā)現(xiàn)的常見(jiàn)突變類型，其在AML中的發(fā)生率可達(dá)15%～35%。研究顯示，F(xiàn)LT3突變與外周血高白細(xì)胞，骨髓高白血病細(xì)胞比例有關(guān)，是影響AML預(yù)后的重要因素[1，2]，F(xiàn)LT3第二酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(tyrosine kinase domain, TKD)點(diǎn)突變主要是835和836位氨基酸的點(diǎn)突變，其發(fā)生率較于FLT3-ITD為低，其預(yù)后意義尚存在爭(zhēng)議。本研究旨在進(jìn)一步探討FLT3突變?cè)贏ML患者中的發(fā)生情況，分析其臨床特征、療效及與預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2010-04至2013-01于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院診治的50例初診AML患者。其中男27例,女23例；中位年齡43歲(8～76歲)。所有患者均經(jīng)過(guò)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫表型、染色體和融合基因檢查確診，參照FAB標(biāo)準(zhǔn)及WHO標(biāo)準(zhǔn)：M01例,M14例,M220例,M38例,M46例,M57例,M64例。5名正常對(duì)照為南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢正常者。

1.2 方法

1.2.1 染色體核型分析 50例病例標(biāo)本應(yīng)用R顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析，治療前抽取患者的骨髓5 ml，肝素抗凝，采用直接法及不加植物血凝素的短期培養(yǎng)法制備染色體標(biāo)本，然后采取改良的熱處理吉姆薩R顯帶技術(shù)分析20個(gè)以上分裂象細(xì)胞核型，核型按“人類染色體國(guó)際命名體制(ISCN2005)”進(jìn)行描述。

1.2.2 基因組DNA提取 所有患者均在獲得知情同意后抽取骨髓液5 ml用于常規(guī)免疫表型和細(xì)胞遺傳學(xué)分析，剩余骨髓液用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，采用傳統(tǒng)酚-氯仿抽提法提取DNA，應(yīng)用紫外分光光度儀測(cè)定樣本的OD值，去離子水稀釋DNA至50 ng/μl，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 FLT3基因突變檢測(cè)

1.2.3.1 FLT3-ITD突變檢測(cè) PCR擴(kuò)增參照文獻(xiàn)[3,4]方法,針對(duì)FLT3基因外顯子14、15設(shè)計(jì)引物(上海英俊公司合成)，正義鏈：5′-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3′；反義鏈：5′-CTTTCAGCATTT-TGACGGCAACC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min，4 ℃保存。野生型擴(kuò)增產(chǎn)物為329 bp處出現(xiàn)單一峰，ITD突變型擴(kuò)增產(chǎn)物為在大于329 bp處出現(xiàn)特異性條帶。FLT3-ITD電泳陽(yáng)性標(biāo)本克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與野生型基因序列比對(duì)。

1.2.3.2 FLT3-TKD點(diǎn)突變檢測(cè) PCR擴(kuò)增，針對(duì)FLT3基因外顯子20設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增片段(479bp)包含D835和I836點(diǎn)突變所在區(qū)域。引物正義鏈：5′-GCTCGGAATCTGCAAAAGAT-3′，反義鏈：5′-CACCACAGTGAGTGCAGTTG-3′。反應(yīng)條件同F(xiàn)LT3-ITD，酶切反應(yīng)按照EcoRV(紐英倫生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行操作，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6 μl 中加入EcoRV內(nèi)切酶6 U，10×EcoRV內(nèi)切酶緩沖液2 μl，加滅菌雙蒸水至終體積20 μl，37 ℃恒溫反應(yīng)3 h進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切結(jié)束后2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，于凝膠成像儀的紫外光下觀察目的條帶。FLT3基因的編碼D835和I836的GATATC序列可被EcoRV識(shí)別酶切，若D835和I836的任一位置發(fā)生點(diǎn)突變的標(biāo)本發(fā)生改變，則EcoRV不能酶切該序列。對(duì)FLT3-TKD(+)標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，送上海英俊公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 克隆測(cè)序 選取瓊脂糖電泳FLT3-ITD突變型標(biāo)本，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收并純化，用pUCm-T載體(上海英俊公司產(chǎn)品)進(jìn)行克隆測(cè)序(上海英俊公司完成)，結(jié)果與正常序列比對(duì)分析突變發(fā)生的位置和類型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSSA16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FLT3-ITD突變分析 正常健康對(duì)照者瓊脂糖電泳分析顯示在329 bp處出現(xiàn)單一條帶，50例初診AML患者中5例FLT3-ITD突變陽(yáng)性，男2例，女3例。中位年齡43(7～67)歲。對(duì)其中3例陽(yáng)性樣本進(jìn)行克隆測(cè)序顯示：ITD片段長(zhǎng)度不等，重復(fù)區(qū)域各不相同，均為框內(nèi)突變。

2.2 FLT3-TKD點(diǎn)突變分析 50例中FLT3-TKD(+)2例(4%)，其中1例為D835 Y，天冬氨酸變?yōu)槔野彼?，?例為I836 M，均為雜合突變。

2.3 染色體核型分析 50例AML患者染色體核型分析結(jié)果顯示，14例無(wú)分裂相，在20例正常核型中FLT3-ITD(+)4例(20%)，F(xiàn)LT3-TKD(+)1例；而16異常核型患者FLT3-ITD(+)1例(6.25%)，F(xiàn)LT3-TKD(+)2例(12.5%)。FLT3-ITD基因突變?cè)谡：诵桶l(fā)生率高于異常核型，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1例FLT3-ITD基因突變異常核型為t(15;17)，2例發(fā)生FLT3-TKD突變的異常核型AML患者中分別是inv(16)和t(15;17)。

2.4 FAB亞型分析 FLT3基因突變可發(fā)生FAB的多個(gè)亞型，5例FLT3-ITD(+)患者中M1、M2、M4、M5、M6各1例，3例FLT3-TKD(+)患者中M3、M2、M4各1例。

2.5 臨床特征分析及預(yù)后 排除FLT3-TKD(+)干擾，將患者按FLT3-ITD突變情況分為FLT3-ITD(+)、FLT3-ITD(-)兩組進(jìn)行分析，各組臨床數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。與FLT3-ITD(-)組相比，F(xiàn)LT3-ITD(+)突變組患者初診時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)及骨髓原始比例均高于正常健康對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在發(fā)病年齡及性別比例上，F(xiàn)LT3-ITD(+)組患者發(fā)病年齡與正常健康對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。將可隨訪預(yù)后的30例患者分為FLT3-ITD(+)、FLT3-ITD(-)兩組，其CR率分別是40%(2/5)、68%(17/25)，中位隨訪時(shí)間9個(gè)月(1～18個(gè)月)。

3 討 論

AML是造血系統(tǒng)的具有細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)的一種異質(zhì)性疾病。在AML的發(fā)病中，細(xì)胞遺傳學(xué)改變是判斷預(yù)后的重要依據(jù)，往往出現(xiàn)染色體異常，有40%～50%的AML患者細(xì)胞遺傳學(xué)特征為正常核型。對(duì)于正常核型的AML，在診斷、預(yù)后分層和微小殘留病灶的監(jiān)測(cè)是目前遇到的一大難題，因此，一些特征性基因突變對(duì)于亞型分類和預(yù)后評(píng)估有著重要的意義。FLT3是Ⅲ類酪氨酸激酶受體的一種，后者包括PDGF-R，KIT和FMS，并在造血祖細(xì)胞的早期增殖分化階段起重要作用。FLT3基因突變可導(dǎo)致配體獨(dú)立的二聚體形成和酪氨酸自磷酸化作用，進(jìn)而激活其下游RAS/MAPK，STAT5和PI3K/AKT異常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制凋亡，推測(cè)其與AML的發(fā)生及復(fù)發(fā)有關(guān)。

目前，多項(xiàng)研究顯示，F(xiàn)LT3基因，尤其是ITD突變與AML患者的臨床表現(xiàn)及預(yù)后相關(guān)[1-3]。本研究在50例AML患者中共檢出FLT3-ITD(+)5例(10%)，F(xiàn)LT3-TKD(+)2例(4.0%)，發(fā)生率較文獻(xiàn)[1,2]報(bào)道少，可能與樣本量少及瓊脂糖電泳檢測(cè)方法敏感度有關(guān)。本研究結(jié)果也顯示，正常核型AML患者FLT3-ITD(+)檢出率20%，高于異常核型(6.25%)，與正常健康對(duì)照組相比，F(xiàn)LT3-ITD(+)突變患者初診時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白及骨髓原始細(xì)胞比例均高，緩解率低，預(yù)后差，在發(fā)病年齡及性別比例上無(wú)明顯差異，與其他研究結(jié)果一致[3-5]。有學(xué)者認(rèn)為，伴有FLT3-ITD(+)突變的AML患者的總生存期(OS)、無(wú)病生存期(DFS)均縮短[6]。由于隨訪時(shí)間較短，本研究未作此方面的統(tǒng)計(jì)。FLT3-TKD突變的預(yù)后影響還處于爭(zhēng)議中，Mead A等[7]報(bào)道年輕AML患者FLT3-TKD突變多伴白細(xì)胞增高，但在具預(yù)后差、細(xì)胞遺傳學(xué)異常的AML患者中罕見(jiàn)，本研究與此報(bào)道一致。

本研究分析，F(xiàn)LT3-ITD(+)、FLT3-ITD(-)兩組CR率結(jié)果顯示，F(xiàn)LT3-ITD(+)AML的CR率較FLT3-ITD(-)AML患者低。與國(guó)外研究結(jié)果一致[6]。LT3突變?cè)谠l(fā)性AML，尤其是正常核型AML患者中有著較高的發(fā)生率。已有文獻(xiàn)[8]報(bào)道，F(xiàn)LT3-ITD(+)患者單獨(dú)使用化療療效較差(合并NPM1突變以及FLT3突變等位基因比例較低的療效較好)，F(xiàn)LT3-ITD(+)患者首次完全緩解后早期(而不是在進(jìn)行多次鞏固化療后)行異基因造血干細(xì)胞移植是最佳的選擇，與化療或自體造血干細(xì)胞移植相比，能夠使無(wú)病生存期延長(zhǎng)3～5年，并降低復(fù)發(fā)率。針對(duì)FLT3基因突變的靶向治療已逐步應(yīng)用于臨床[9]，為診斷和治療AML提供了新的手段和策略[10]。因此，臨床上篩查FLT3基因突變對(duì)AML患者治療及預(yù)后均有指導(dǎo)意義。

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(2013-11-28收稿 2014-01-16修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

EffectofFLT3genemutationsonacutemyeloidlecukemia

ZHU Baigui1, ZHANG Sujiang2, and LI Jianyong2. 1.Department of Hematology, Jiangsu Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Yangzhou 225003, China. 2. Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210029, China; 3.Department of Respirqtory, 263 Hospital Clinical Division General Hospital of Beijing Military Command, Beijing 100700, China

ObjectiveTo study the influence of FLT3 gene mutation on acute myeloid leukemia(AML).MethodsWe used PCR combined with direct sequencing and cloning sequencing to investigate FLT3 mutation in 50 AML patients, and further analyzed clinical data of these patients.ResultsFLT3-ITD mutation was found in 20% AML patients with normal karyotype, which was higher than that in patients with abnormal karyotype. Compared with wild-type group, the WBC count, hemoglobin and blast cells in bone marrow were all high in FLT3-ITD positive group which with lower CR ratio.ConclusionsFLT3 mutation is the major molecular marker of AML patients with normal karyotype, which is very important for prognosis analysis and targeted therapy of AML.

FMS-like tyrosine kinase3; acute myeloid leukemia; mutation

朱柏貴，本科學(xué)歷，主任醫(yī)師，E-mail：zhubogui@163.com

1.225003揚(yáng)州，武警江蘇總隊(duì)醫(yī)院血液科；2.210029，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科；3.100700，北京軍區(qū)總醫(yī)院263臨床部呼吸科

高鴻敏，E-mail: gaohongmin1975@126.com

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