唐靜靜，何潤霞，王 魯

（1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 貴州省生化工程中心，貴州 貴陽 550025）

奶牛乳房炎是由各種病因引起的乳房炎癥，給奶牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。我們前期試驗中報道了中藥復方透皮劑在奶牛隱性乳房炎的治療效果[1]，本復方是由金銀花、連翹、蒲公英、大黃、當歸等中藥組成的中藥制劑,具有清熱解毒、消腫散結之功效。為了進一步研究其療效，我們嘗試將中藥復方改變?yōu)樽⑸鋭┯糜谌閰^(qū)灌注進行臨床實驗，并進行熱源檢查及急性毒性試驗，采用高效液相色譜(HPLC)和紫外分光法檢測綠原酸、多糖、大黃酸、大黃素的含量等，旨在評價其臨床療效及其質(zhì)量控制建立有效方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀，Agilent 1100Series LC/MSDSL；UV-2000 紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；LDZX-50KB立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 藥材及試劑 金銀花、蒲公英、連翹、瓜蔞、當歸、大黃、黃芪、芙蓉花8 味中藥。購自貴陽市同濟堂藥店；綠原酸、大黃酸，均購自中國藥品生物制品檢定所，含量為80%；大黃素購自武漢遠城科技發(fā)展有限公司；葡萄糖、有機化學試劑均為國產(chǎn)分析純或色譜純試劑。

1.3 動物 昆明系清潔級小鼠，購自貴陽醫(yī)學院實驗動物中心[SCXK（黔）2002-0001]；新西蘭大耳白家兔，購自解放軍第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所醫(yī)學實驗動物中心[SCXK (渝) 2007-0005]。

1.4 金英黃歸液注射的制備[2]將8味中藥按比例混合，共500g，用50%乙醇浸泡30 min（料液比10∶1），回流提取2 h，多層紗布過濾。藥渣再加50%乙醇（料液比8∶1），回流提取1 h，多層紗布過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，加入石油醚萃取，水相濃縮至2 g/mL，加乙醇，將溶液依次調(diào)整為70%、75%、80%乙醇溶液，每次4 ℃醇沉24 h，取上清進行50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇，將無醇的濃縮液加入注射用水，制備成1 g/mL的溶液，為澄明透亮的淡黃色液體狀，加0.5%活性炭，煮沸，攪拌15 min，過濾到熱源處理后的量筒中，制備成1 g/mL 的注射液，調(diào)pH 值為7.2，然后過0.22 μm濾膜除菌。在常溫保存，1月后檢查是否有可見沉淀物，檢測其pH 值。

1.5 急性毒性試驗[3]取體重20±2 g 健康小鼠50只，隨機分成5 組，雌雄各半。4 個試驗組分別灌胃0.625、1.25、2.5、5.0 g/kg 中藥，空白組灌胃生理鹽水，劑量0.5 mL/只，給藥1 次，常規(guī)飼養(yǎng)14 d。觀察小鼠的臨床表現(xiàn)和死亡情況，以死亡為主要觀察指標。

1.6 熱原檢查 參考文獻[4]方法，取健康的新西蘭大耳兔3 只，體重2.56～3.00 kg，雄性，注入給藥前，每隔1 h 測量體溫1 次，共測4 次，4 次體溫在38.7 ℃～39.1 ℃范圍內(nèi)，符合供熱原試驗用，第三天，在測定其正常體溫后15 min 內(nèi)，自耳靜脈緩緩注入20 mL 注射液，并溫熱至38 ℃。然后每隔1 h測量體溫1 次，共3 次。

1.7 有效成分檢測

1.7.1 中藥復方中多糖含量的測定 參考文獻[5]，黃芪多糖的含量檢測采用超聲提取和苯酚-濃硫酸比色法對黃芪多糖進行含量測定，先精確稱取105 ℃干燥恒重的葡萄糖標準品100 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。依次稀釋成0.008 mg/mL，0.016 mg/mL，0.024 mg/mL，0.032 mg/mL，0.040 mg/mL，0.048 mg/mL，0.056 mg/mL（即依次吸取0.4 mL，0.8 mL，1.2 mL，1.6 mL，2.0 mL，2.4 mL，2.8mL分別置于容量瓶50 mL規(guī)格中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻）。依次精密吸取1.0 mL各濃度的溶液加入10 mL試管中，空白孔加入蒸餾水，迅速加入5 mL濃硫酸和2%苯酚溶液0.15 mL，振蕩5 min，置于沸水浴上加熱15 min，用水稀釋至刻度，然后置于冷水浴中冷卻30 min，搖勻。以空白為參比，紫外分光光度計在490 nm 波長處，測定其吸光度值（OD490值），重復三次，取平均值。以標準品濃度（mg/mL）為橫坐標，以其吸光度值（OD490值）為縱坐標繪制標準曲線。

本方法以無水葡萄糖標準品作標準曲線，為了除去單糖的影響，或檢測注射液中是否含有單糖。經(jīng)斐林試劑鑒定呈陰性，說明單糖在提取過程中已被除去。將樣品溶液的原復方用蒸餾水稀釋成4 倍，參照標品的處理方法進行測定。

1.7.2 中藥復方中綠原酸含量的測定 參考文獻[6-7]方法，精密稱取綠原酸標準品（98%）5.08 mg 置于50 mL 的棕色量瓶中，加甲醇約30 mL，超聲15 min，冷卻加甲醇稀釋至刻度，吸取標樣1 mL 置于10 mL棕色瓶中，加甲醇至刻度即可，過0.45 μm的有機濾膜即可。另外精密量取25 mL 注射用藥液于50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲15 min，用甲醇稀釋至刻度，過0.45 μm的有機濾膜，將色譜純甲醇其稀釋10倍即可。將制備好的樣品注入高效液相色譜儀，其檢測條件：C18柱，流動相為乙腈:0.4%磷酸（10∶90），327 nm檢測波長，30 ℃柱溫。測量綠原酸標準品的峰面積（A標）、樣品的峰面積（A樣），根據(jù)公式計算待測樣品中綠原酸的含量：mg/mL=C標×A樣/A標。

1.7.3 中藥復方中大黃酸、大黃素含量的測定參考文獻[8]方法，精密稱取大黃酸標品（98%）1.75 mg，置于50 mL 量瓶中，加入50%甲醇超聲15 min，再加50%甲醇稀釋至刻度，定容，過0.45 μm的有機濾膜即可。取大黃素（80%）2.5 mg 溶于甲醇50 mL，超聲15 min。定容過濾即可。另精密量取5 mL 注射液，用氯仿萃取5 次，每次10 mL，合并氯仿液，水浴上蒸干，殘渣加50%甲醇溶解，超聲20 min，用50%甲醇稀釋定容至50 mL，液體過0.45 μm 有機濾膜即可。將制備好的樣品注入高效液相色譜儀。其檢測條件：C18 柱，流動相為甲醇:0.1%磷酸（78∶22），流速0.8 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫30 ℃。測量大黃酸、大黃素標準品的峰面積（A標）、樣品的峰面積（A樣），根據(jù)公式計算待測樣品中大黃酸、大黃素的各自的含量：mg/mL=C標×A樣/A標。

1.8 乳區(qū)注射用藥對奶牛乳房炎的治療效果觀察

1.8.1 隱性奶牛乳房炎治療 隨機選取胎次、年齡、泌乳月相近，身體狀況良好、乳房無臨床異常、乳汁無肉眼可見變化的CMT 檢測陰性的健康奶牛9 頭（36 個乳區(qū)）為陰性對照組，CMT 檢測陽性（患有隱性乳房炎）的奶牛6 頭（7 個乳區(qū)），隨機分成2組，陽性對照組6 頭（陽性乳區(qū)7 個）和中藥治療組7 頭（陽性乳區(qū)13 個）。治療組奶牛早、晚擠完奶后，用溫水清洗患牛乳區(qū)，干毛巾擦干，經(jīng)乳導管每個乳區(qū)注入中藥20～50 mL，每天2 次，連續(xù)用藥3 d，第5 天奶牛乳區(qū)嚴格消毒，先棄去頭3 把奶，采取乳汁按CMT 法檢測乳汁，評價治療效果。

1.8.2 臨床型奶牛乳房炎治療 對臨床上發(fā)生奶牛乳房炎的病牛進行臨床診斷及CMT 診斷，確定為臨床型乳房炎的奶牛7 頭用中藥進行治療，奶牛早、晚擠完奶后，用溫水清洗患牛乳區(qū)，干毛巾擦干，酒精消毒，每個乳區(qū)注入中藥注射用藥20～50 mL，每天2 次，連續(xù)用藥3 d，第5 天奶牛乳區(qū)進行臨床診斷結合CMT 法檢測乳汁，評價治療效果。

2 結果

2.1 急性毒性試驗結果 試驗用小鼠無1 只死亡，LD50＞5 g/kg 體重，說明該藥物毒性小。

2.2 熱原檢查結果 結果表示，3 只家兔的體溫升高值均低于0.6 ℃，且體溫升高總數(shù)低于1.4 ℃，認為該藥熱原檢查合格[9]，結果見表1。

表1 注射用藥家兔熱原試驗

2.3 金英黃歸注射液中多糖的含量 以標準品濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度值（OD值）為縱坐標，求得標準曲線方程為y=14.594x-0.038（見圖1）。根據(jù)標準曲線方程，計算出注射液（生藥濃度1 g/mL）中多糖濃度為0.48×10-1mg/mL。

圖1 U V測得糖標準曲線

2.4 金英黃歸注射液中綠原酸的含量 綠原酸標準品HPLC圖結果顯示（見圖2），綠原酸的出峰時間：5.96 min，其面積為2 803，待檢樣品在5.99 min時有出峰，其面積為8 363.9（見圖3），根據(jù)公式計算，結果注射液中綠原酸的含量為0.59 mg/mL。

圖2 綠原酸標準品H PLC

圖3 樣品H PLC

圖4 大黃酸標準品H PLC

圖5 大黃素標準品H PLC

2.5 金英黃歸注射液中大黃酸、大黃素的含量 標準品HPLC圖結果顯示（圖4、5），大黃酸4.62 min，大黃素7.57 min，其面積分別為1 210.5、1 617.1，待測樣品其在4.61 min 時有出峰，其面積為9.3，在7.56 min時有出峰，其面積為67.5（見圖6），根據(jù)公式計算，結果注射液中大黃酸的含量為0.26×10-2mg/mL，大黃素的含量為0.17×10-1mg/mL。

圖6 樣品H PLC

2.6 乳區(qū)注射用藥對奶牛乳房炎的治療效果觀察CMT檢測結果顯示，隱性乳房炎的奶牛通過3 d中藥乳區(qū)注射用藥治療后治愈率達53.8%，有效率達92.3%；患隱性乳房炎奶牛乳區(qū)自愈率為0；健康奶牛乳區(qū)發(fā)病率為13.9%；治愈率、有效率經(jīng)X2檢驗中藥透皮劑治療組與陽性對照組比較差異顯著或極顯著（P＜0.05，P＜0.01），結果見表2。臨床型乳房炎的奶牛通過3d中藥乳區(qū)注射用藥治療后臨床診斷其治愈率達88.9%，有效率達88.9%；CMT 診斷治愈率達33.3%，有效率達88.9%（見表3）。

3 討論

3.1 中藥及其復方的藥效作用其根本原因是其有效成分在發(fā)揮作用，制備中藥及其復方后對其有效成分的檢測顯得尤為重要，但由于中藥及其復方有效成分的多樣性，不可能完整對其進行檢測。本復方中選擇了金銀花、黃芪、大黃等作為主要藥物，這些中藥的有效成分如綠原酸[7]、多糖、大黃酸等應該成為本制劑質(zhì)量控制的基礎數(shù)據(jù)。檢測結果顯示，本復方的綠原酸、多糖、大黃素含量分別為0.59 mg/mL、0.48×10-1mg/mL、0.17×10-1mg/mL，說明綠原酸、多糖、大黃素在本復方中占有較大的含量，可以確定為本制劑的質(zhì)量控制指標。而大黃酸的含量為0.26×10-2mg/mL，可以不考慮為本制劑質(zhì)量檢測的指標。

表2 乳區(qū)注射用藥治療奶牛隱性乳房炎療效

表3 乳區(qū)注射用藥治療奶牛臨床型乳房炎療效

3.2 在常溫下保存制備的復方制劑，1 月后檢查無可見沉淀物，仍然為澄明透亮的淡黃色液體狀，說明制備的注射劑較穩(wěn)定，其pH 值為7.2，家兔熱源檢測說明該注射劑無熱源，LD50＞5 g/kg，說明制劑毒性小[3]，這些數(shù)據(jù)說明該制劑在臨床上使用是安全的。在確保使用安全情況下，我們選擇了臨床型和隱性型兩種奶牛乳房炎進行了臨床試驗，結果顯示，金英黃歸注射液對臨床型的乳房炎的治愈率和有效率分別為33.3%和88.9%，同時該注射液對隱性乳房炎的治愈率和有效率分別為38.5%和84.6%，表明該中藥配方對奶牛的乳房炎具有一定的治療效果，這為進一步推廣應用打下了試驗數(shù)據(jù)。

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