謝美娜，范慧芬，陳朝喜，黃志宏

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

灰兜巴（HDB）又名閉口袋，是生長在海拔1 200多米以上的老茶樹叢內(nèi)一種洞穴紅蜘蛛吐的絲巢，也有人認(rèn)為是一種菌科植物[1-2]。趙勁航等人利用中藥復(fù)方灰兜巴灌胃治療糖尿病動物模型，發(fā)現(xiàn)該中藥可降低血糖濃度、抑制體重減輕、控制尿量增加和加速糖代謝作用[3]。孟凡欣、鄭丹等人的研究發(fā)現(xiàn)，灰兜巴多糖能夠降低糖尿病模型小鼠血糖濃度，同時降低血液中丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和尿素氮（BUN）含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）活性[4-6]。劉艷的研究發(fā)現(xiàn)，灰兜巴治療糖尿病的有效成分主要是多糖[7]。多糖提取方法主要有水提醇沉法、超聲波提取法、酶解法和超臨界流體萃取法等。酶解法操作較繁瑣，超臨界流體萃取法設(shè)備要求高，也不太適合強極性的多糖的提取[8]，超聲波提取法雖然提高了粗多糖提取率，但提取物所含固體雜質(zhì)增多[9-10]。此外，上述3 種多糖提取方法不便于進行工業(yè)化生產(chǎn)。筆者選擇水提醇沉法提取灰兜巴粗多糖，結(jié)合灰兜巴粗多糖中多糖的含量測定，同時考察時間、溫度和料液比3 個因素，通過正交試驗選取最佳的提取工藝。

1 材料

灰兜巴購自四川省峨眉山市，晾干粉碎。95%乙醇、蒽酮等實驗試劑均為分析純。DU 800 可見-紫外分光光度計，美國貝克曼公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-3000，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；Eppendorf 離心機5804R，德國艾本德公司等。

2 方法

2.1 灰兜巴粗多糖的提取方法 利用中藥多糖水提醇沉法，采用正交試驗對灰兜巴多糖水提條件進行優(yōu)化，并確定最佳提取方法[11]。稱取粉碎后灰兜巴10 g 于三角瓶中，按照設(shè)計好的正交試驗條件水浴提取，然后以5 000 r/min 離心15 min，上清液減壓濃縮為原體積的2/5，在不斷攪拌下緩慢加入3 倍體積的95%乙醇，4 ℃靜置12 h，8 000 r/min（4 ℃）離心3 min，收集沉淀，經(jīng)無水乙醇、丙酮、石油醚洗滌，再置于真空干燥箱干燥得到灰兜巴粗多糖。利用硫酸-蒽酮法測定灰兜巴粗多糖中多糖含量。

2.2 正交試驗 以溫度、時間和料液比3 因素，每個因素選取5 個水平，選用L25（56）正交試驗確定灰兜巴粗多糖最佳提取方法，水平因素見表1。

表1 正交試驗因素水平

2.3 灰兜巴多糖含量測定 試驗采用硫酸-蒽酮法檢測灰兜巴粗多糖中多糖含量[12]。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖10 mg，溶于少量蒸餾水后定容到100 mL，制成100 μg/mL 葡萄糖溶液。

稱取0.2 g蒽酮溶于100 mL濃硫酸中制成2 g/mL蒽酮試劑。按表2 中順序加入各試劑，蒽酮試劑要緩慢加入并在冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中。水再次沸騰后計時準(zhǔn)確煮沸10 min，自來水冷卻，室溫放置10 min，以0 號管為空白對照，于620 nm 比色。以吸光度A為縱坐標(biāo)，以糖質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 硫酸-蒽酮法試劑

2.3.2 灰兜巴多糖質(zhì)量測定 取灰兜巴多糖水提液1 mL 按2.3.1 中方法測吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線查到多糖質(zhì)量。由下面公式計算灰兜巴多糖提取率。

3 結(jié)果

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=0.0041x+0.0754，線性相關(guān)系數(shù)為0.9998，葡糖糖在0 到80 μg/mL 與吸光度線性關(guān)系良好。

3.2 正交試驗 利用L25（56）正交試驗，每個試驗平行3 次，以灰兜巴多糖提取率為結(jié)果。L25（56）正交試驗設(shè)計和結(jié)果見表3，對正交試驗進行方差分析結(jié)果見表4。從表3 中極差分析可知各因素對灰兜巴多糖提取率的影響順序為A(溫度)＞B(時間) ＞C(料液比)，說明溫度對灰兜巴多糖提取率影響最大，時間其次，最后是料液比，從表4 方差分析表中F 值可知溫度對多糖提取率影響顯著。由正交試驗結(jié)果均值可知最佳試驗組為A4B3C2，即最佳提取工藝是提取溫度90 ℃，提取時間為1.5 h，料液比為1∶10。

3.3 驗證試驗 以正交試驗所得的灰兜巴多糖最佳提取工藝來進行驗證試驗。3 次平行試驗結(jié)果平均值為1.305%，RSD值為0.575%（n=3），無顯著性差異。

表4 灰兜巴水提物正交試驗方差分析

4 討論

灰兜巴水煎液是四川峨眉地區(qū)治療糖尿病的一個民間偏方，且效果良好。趙勁航等人用灰兜巴治療鏈脲佐菌素或四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病大鼠和小鼠模型，通過對模型動物的血糖、耐糖量、尿量和體重測定，證實灰兜巴對糖尿病有治療作用[3]。孟凡欣的研究表明，灰兜巴多糖具有明顯的降糖作用，主要是通過清除體內(nèi)氧自由基，降低MDA含量起到降糖作用[4]。但是關(guān)于灰兜巴治療糖尿病的具體機制尚不明確，是以后灰兜巴治療糖尿病的研究重點。

表3 灰兜巴水提物正交試驗設(shè)計和結(jié)果

本試驗利用傳統(tǒng)的多糖提取方法即水提醇沉法提取灰兜巴粗多糖，通過硫酸-蒽酮法檢測灰兜巴多糖含量。由硫酸蒽酮法標(biāo)準(zhǔn)曲線可知多糖在0～80 μg/mL 具有良好的線性關(guān)系。利用L25（56）正交試驗，通過溫度、時間和料液比3 個因素，每個因素5 個水平全面考察其對灰兜巴多糖提取率的影響。結(jié)果顯示，試驗組A4B3C2 的多糖提取率最高，即最佳提取工藝是提取溫度為90 ℃，提取時間為1.5 h，料液比為1∶10。以提取溫度90 ℃，提取時間1.5 h，料液比1∶10 的最佳工藝進行3 次驗證性試驗，所得結(jié)果無顯著性差異，可知該最佳提取方法穩(wěn)定可行。

陳燕忠等提取灰兜巴多糖試驗中，未考察溫度因素[11]。張琳華[12]、林志鑾[13]和劉長建[14]等人在研究中藥多糖提取工藝時，均以溫度做為一個考察因素，結(jié)果也顯示溫度在正交試驗中比其他因素影響顯著。溫度對多糖提取影響顯著，可能是溫度過低造成多糖提取不充分，溫度過高可以破壞多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而影響多糖提取率和藥物效果。本試驗中選擇提取溫度、提取時間、料液比3個因素，每個因素設(shè)5 個水平，全面考察溫度、時間、料液比對灰兜巴多糖提取率的影響，為以后對灰兜巴多糖的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

目前，多糖提取方法主要包括水提醇沉法、超聲波提取法、酶解法和超臨界流體萃取法等。多糖超聲波提取法比水提醇沉法所得固體量較多，但是多糖提取量沒有增加，可能因提取過程復(fù)雜，所得雜質(zhì)增多，且超聲波提取法沒有水提醇沉法提取工藝成熟[9-10]。酶解法可以縮短多糖提取時間，增加多糖提取率，但是酶解法生產(chǎn)成本較高，操作較為繁瑣[15]。超臨界流體萃取技術(shù)具有提取率高的特點，所以在中藥提取中應(yīng)用越來越廣泛，但是該技術(shù)對設(shè)備要求較高，也不適合強極性物質(zhì)的提取[8]。本試驗選擇恒溫水浴條件下，利用水提醇沉法提取灰兜巴粗多糖，該方法有耗時較長、消耗溶劑較多的缺點，但其工藝較為成熟，便于進行工業(yè)化生產(chǎn)。

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