汪君民 龔騰云 (南通大學體育科學學院，南通 226007)

視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)主要是由脂肪細胞分泌的，是一種特異性結(jié)合視黃醇的蛋白質(zhì)［1］。研究發(fā)現(xiàn)，RBP4 這一脂肪因子會導致胰島素抗性，在胰島素抗性發(fā)展中起到一個關(guān)鍵作用，在具有胰島素抗性的小鼠體內(nèi)及肥胖、2 型糖尿病病人體內(nèi)，血清RBP4 的水平升高［2］。升高的RBP4 水平與心血管危險因子關(guān)系密切，并且可用來作胰島素抵抗程度的評價［3］。研究表明，運動訓練可以降低不同年齡階段的研究對象的RBP4 水平［3，4］，提示運動可以通過RBP4 水平的降低來提高胰島素的敏感性。

糖尿病的病因及發(fā)病機制尚未完全闡明，但最近炎癥學說頗受關(guān)注，認為炎癥在其發(fā)病機制中起重要的媒介作用。其中多種細胞因子包括許多白細胞介素介導了此類反應。白細胞介素通過自分泌、內(nèi)分泌和旁分泌的方式加速或者抑制此類炎癥反應的過程。而其中的IL-2 與糖尿病的發(fā)病和進程，以及與糖尿病相關(guān)的心血管疾病的關(guān)系最為密切，并且IL-2 還具有炎癥和免疫系統(tǒng)之外的重要調(diào)節(jié)作用，如通過全身給藥IL-2 能阻止非肥胖糖尿病小鼠的病程［5］等。而在胰島素抵抗情況下，運動導致IL-2 及其受體水平如何變化目前未見相關(guān)報道。

本文采用重組RBP4 注射活體大鼠，獲得高RBP4 誘導的胰島素抵抗大鼠模型，觀察運動后胰島素抵抗和大鼠胸腺凋亡及免疫指標變化，為臨床控制胰島素抵抗及糖尿病預防提供新的思路和靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 胰島素(Sigma-Aldrich)、2-Deoxy-D-［I-3H］-glucose(Sigma-Aldrich)，RBP4 ELISA 試劑盒(Biosource)，胰島素放射免疫試劑盒(Biogenesis)，重組RBP4(Alexis)，IL-2、IL-2R 定量試劑盒、考馬斯亮藍G250 蛋白測定試劑盒、凋亡細胞試劑盒均購自廈門慧嘉生物技術(shù)公司。酶聯(lián)免疫檢測儀、流式細胞儀(Beckman Coulter)等儀器。

1.2 方法

1.2.1 重組RBP4 注射與運動方案 雄性SD 大鼠8 周齡22 只，體重183～211 g，隨機分成RBP4 +運動組(RE)10 只、RBP4 安靜組(RR)6 只，2 組大鼠給予重組RBP4 腹腔注射［2］，3 μg/g 體重，每12 h一次，持續(xù)注射4 周。其余6 只為安靜對照組(C)。RE 組大鼠按照Ploug 方法［6］進行游泳訓練4 周，泳池為直徑53 cm 內(nèi)壁光滑的塑料桶，水深70 cm，水溫為35±2℃，游泳訓練開始時間為晚上6 點;大鼠先進行每天15 min 適應性游泳訓練共2 天，從第3天開始采取每天無負重游泳，每次持續(xù)60 min，每周訓練6 天，周日休息，共持續(xù)4 周。訓練中，大鼠如出現(xiàn)反復下沉或溺水傾向，及時撈出，休息后片刻，再投入水中，直至補足60 min 訓練時間;同時使用小木棍及時驅(qū)趕，使大鼠持續(xù)運動，避免其出現(xiàn)抱團、漂浮等現(xiàn)象，保證訓練效果。將安靜對照組大鼠在浸水后撈出。游泳結(jié)束后撈出，以干毛巾擦拭，暖風機吹干。

1.2.2 血清RBP4 和胰島素抵抗指數(shù)的檢測 采用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定RBP4;采用放射免疫分析法測定胰島素。采用穩(wěn)態(tài)模式評估法評價胰島素敏感性，其原理是:假設(shè)外周組織和肝臟的胰島素抵抗相等，按胰島素和血葡萄糖在周圍組織、肝和胰腺等相互影響而建立起來的數(shù)學模型。計算公式為［7］:HOMA-IR(胰島素抵抗指數(shù))=空腹胰島素(國際單位/L)×以空腹葡萄糖(mmoL/L)/22.5。胰島素抵抗程度評估參照謝鐵男［8］等人的計算方法。

1.2.3 胸腺細胞凋亡光鏡觀察 實驗結(jié)束后斷頭處死動物，取出胸腺進行凋亡細胞原位末端標記及觀察。采用TUNEL 方法［9］:將制備的胸腺組織石蠟切片脫蠟、乙醇水化，PBS 沖洗后蛋白酶K 消化，TDT 酶/生物素-dUTP 反應液等處理(具體步驟按試劑盒說明進行)，最后二甲苯透明，樹膠封固，顯微鏡下觀察結(jié)果并攝像。陽性標準為核呈棕紅色、背景清晰。

1.2.4 IL-2、IL-2R 指標檢測 外周血中IL-2、IL-2R 的含量檢測用ELISA 法，參照試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 大鼠血清中GM-CSF 水平檢測 本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA 法。用抗鼠GM-CSF 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的GM-CSF 與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人GM-CSF，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin 與生物素結(jié)合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492nm 處測OD 值，GMCSF 濃度與OD 值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中GM-CSF 濃度。

1.2.6 胸腺及脾臟指數(shù) 用分析天平稱取胸腺及脾臟重量后，計算依據(jù)下列公式:胸腺(或脾臟)指數(shù)(g/100g)=100 ×胸腺(或脾臟)重量/體重。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0 程序處理，以x-±s 表示，Kolmogorov-Smirnov 檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)分布，組間進行方差分析，采用LSD 檢驗，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義，P ＜0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清RBP4 和胰島素抵抗指數(shù)變化 4 周后，RE 組和RR 組大鼠血清RBP4 水平顯著高于C 組(P ＜0.01);RE 組大鼠血清RBP4 水平顯著低于RR 組(P ＜0.01);RE 組和RR 組大鼠HOMA-IR 顯著高于C 組(P ＜0.01);RE 組大鼠HOMA-IR 顯著低于RR 組(P ＜0.01，見表1。

2.2 觀察大鼠胸腺細胞凋亡的數(shù)量及分布部位 見圖1。正常安靜對照組(C):在胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)部位均可見被染成棕紅色的凋亡細胞，陽性細胞占整個胸腺細胞比例較少。

RBP4 安靜組(RR):在胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)部位見棕紅色的凋亡細胞較正常對照組明顯增多，陽性細胞占整個胸腺細胞的比例增大。RBP4 +運動組(RE):在胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)部位見棕紅色的凋亡細胞較正常安靜對照組增多，但較RBP4安靜組明顯減少。

2.3 外周血中IL-2、IL-2R 的表達變化 4 周后，RR 組和C 組大鼠外周血IL-2、IL-2R 表達差異不大;RE 組大鼠外周血IL-2 表達高于RR 組(P ＜0.05)，而IL-2R 表達明顯低于RR 組(P ＜0.05);其比值高于RR 組(P ＜0.01)。見表2。

2.4 大鼠血清中GM-CSF 水平變化 4 周后，RR組和C 組大鼠外周血GM-CSF 水平相比明顯增加，且具有顯著差異性(P ＜0.01)，同時RE 組和C 組比較則沒有顯著性差異。見表3。

2.5 大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的變化 4 周后，RR 組與C 組大鼠相比，體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)都有所下降(P ＜0.05);而RE 組與C 組大鼠相比體重無顯著差異，與RR 組比較胸腺指數(shù)(P ＜0.05)、脾臟指數(shù)明顯提高(P ＜0.01)。見表4。

表1 血清RBP4 和胰島素抵抗指數(shù)變化Tab.1 Changes in serum RBP4 and HOMA-IR of rats

表2 外周血中IL-2、IL-2R 的表達變化Tab.2 Changes of IL-2 and IL-2R expression

表3 大鼠血清中GM-CSF 水平Tab.3 Changes GM-CSF in serum of rats

表4 大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的變化Tab.4 Changes of weight，thymus index and spleen index of rats

圖1 各組胸腺皮質(zhì)、髓質(zhì)光鏡下細胞凋亡情況Fig.1 Changes in thymus cortex and medulla of apoptosis

3 討論

3.1 大鼠血清RBP4 變化情況 胰島素抵抗不僅是2 型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)，還是代謝綜合征(糖尿病、肥胖、高血壓病、動脈粥樣硬化、脂肪肝等疾病)的共同病理基礎(chǔ)。胰島素能夠提高組織對葡萄糖的攝取率，機制是胰島素與靶細胞的胰島素信號蛋白相互作用，最終能夠增加葡萄糖轉(zhuǎn)運體從細胞內(nèi)池向細胞膜的運動［10］。胰島素在不同的組織、細胞中通過復雜的信號級聯(lián)放大作用發(fā)揮不同的生理作用。本研究中大鼠經(jīng)過RBP4 注射4 周后，與C 組相比，RE 組和RR 組大鼠均出現(xiàn)胰島素抵抗;對RBP4 注射后的大鼠進行運動干預后發(fā)現(xiàn)，雖然大鼠血清RBP4 水平仍高于C 組，但與RR 組比較胰島素抵抗指數(shù)明顯下降。與此對應的是:RE 組和RR 組大鼠胰島素抵抗指數(shù)顯著高于C 組，RE 組大鼠明顯低于RR 組。說明運動能夠抵抗RBP4 誘導的胰島素抵抗。

3.2 光鏡觀察結(jié)果分析 細胞凋亡(Apoptosis)又稱細胞程序性死亡。是一種不同于壞死的、由基因調(diào)控的細胞主動死亡形式。細胞凋亡與免疫細胞的發(fā)育分化及行使功能等各個方面有密切的聯(lián)系。有研究［11］指出:創(chuàng)傷應激大鼠胸腺細胞凋亡增多明顯，同時其增殖能力降低，并且凋亡的細胞主要集中于胸腺依賴區(qū)的淋巴細胞，即T 細胞。探討運動對胰島素抵抗大鼠免疫細胞凋亡的影響，有助于胰島素抵抗和糖尿病人群尋求更好的運動方式減輕胰島素抵抗帶來的免疫力的下降，提高患者的生活質(zhì)量。

本研究結(jié)果顯示:運動+RBP4 組在胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)部位見棕紅色的凋亡細胞較正常安靜對照組增多，但較RBP4 安靜組明顯減少。結(jié)果提示，RBP4 誘導的胰島素抵抗不僅能影響外周成熟的T淋巴細胞功能，而且能影響中樞免疫器官中未成熟的淋巴細胞，胸腺細胞在發(fā)育成熟過程中凋亡增多，進而可能導致進入外周血循環(huán)中的成熟T 細胞減少，免疫力降低。本研究說明運動對RBP4 誘導的胰島素抵抗大鼠胸腺細胞凋亡有明顯的抑制作用，可以增強胰島素抵抗大鼠的免疫力。

3.3 大鼠外周血IL-2 及IL-2R 表達變化情況 IL-2 是由Th 細胞IL 抗原或絲裂原刺激下和IL-1 誘導下分泌的一種15 kD 的糖蛋白，能夠促進淋巴細胞有絲分裂，增強殺傷細胞的殺傷功能和輔助抗體生成等，在機體的免疫應答及調(diào)節(jié)中起著重要的作用。血清IL-2 水平是末梢血單核細胞功能的一個敏感而又量化的指標，其生物學作用是通過和靶細胞上特異性高親和力的IL-2R 相互作用來完成的。白細胞介素2 受體有兩種，即存在于細胞表面的IL-2 膜受體(mIL-2R)和存在于體液中的可溶性IL-2 受體(IL-2R)，這兩種受體都可結(jié)合IL-2，中和活化T 細胞周圍過多的白介素2，具有免疫調(diào)控作用。IL-2具有增強荷瘤機體免疫功能的作用［12］。錢令波等［5］研究表明:IL-2 對大鼠的心臟收縮功能具有明顯抑制作用;可明顯改善糖尿病(高葡萄糖濃度)誘發(fā)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能減弱;可減弱高葡萄糖濃度誘發(fā)的冠狀動脈血管阻力的升高。

本研究結(jié)果表明，RE 組與RR 組大鼠血清IL-2表達升高、IL-2R 表達降低(P ＜0.05)，且IL-2/IL-2R 比值明顯增大(P ＜0.01)，其升高機理可能是4周運動訓練作用于激活的T 淋巴細胞，使其對IL-2R 表達與釋放減少，而IL-2R 可結(jié)合血清中的IL-2，具有免疫抑制作用。結(jié)合錢令波［5］的研究結(jié)果，說明運動不但能夠改善胰島素抵抗大鼠的免疫機能，而且能夠改善心臟舒張功能，減弱冠狀動脈血管阻力的升高，為胰島素抵抗患者提供了鍛煉預防糖尿病的科學依據(jù)。

3.4 大鼠血清中GM-CSF 水平變化 GM-CSF 是一種來源于T、B 淋巴細胞、巨噬細胞、纖維細胞及間質(zhì)細胞的一種糖蛋白，在炎癥反應過程中由損傷內(nèi)皮細胞釋放的一種多肽類激素樣造血生長因子，它可促進造血祖細胞分化成單核巨噬細胞，并維持單核巨噬細胞的生長、增殖、分化，為炎癥反應的敏感的標志物［13］。它可刺激骨髓早期母細胞分化，并促進這些細胞的成熟和增殖，對機體的免疫、抗感染、造血能力具有重要的調(diào)節(jié)和促進作用。是聯(lián)系生物體內(nèi)三大調(diào)節(jié)系統(tǒng)的重要介質(zhì)。它可通過影響網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，引起免疫調(diào)節(jié)功能的紊亂，特別是表現(xiàn)在T、B 細胞比例發(fā)生紊亂，使CD4/CD8 比值發(fā)生改變［14］。

本文結(jié)果表明，RR 組血清中GM-CSF 水平非常顯著地高于正常安靜對照組(P ＜0.01)，而RE 則與正常安靜對照組比較無顯著差異(P ＞0.05)，這一結(jié)果表明，血清GM-CSF 確實與胰島素抵抗發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。其升高的機理有可能是:由于RBP4 引起的大鼠胰島素抵抗導致細胞免疫功能受到抑制，大鼠機體存在非特異性免疫調(diào)控增強之故。但具體是由于過度活化的T 細胞分泌增加所致，還是其他因子分泌增加所致，抑或是骨髓干細胞及基質(zhì)細胞異常分泌增加所致尚需深入研究。RE 組血清中GM-CSF 水平變化不具顯著性，可能是運動訓練部分恢復了細胞免疫功能，從而抵消了RBP4 引起的胰島素抵抗，其具體機理需要進一步探索。

3.5 大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)組間關(guān)系 胸腺為中樞免疫器官，是T 淋巴細胞發(fā)育及成熟的場所。脾是人體最大的外周免疫器官，B 淋巴細胞在此發(fā)育、成熟，脾也是機體在抗原刺激下發(fā)生免疫應答的場所。因此胸腺、脾臟結(jié)構(gòu)的衰退和功能下降勢必會影響機體的體液、細胞免疫功能，導致機體免疫功能失調(diào)。胸腺指數(shù)和脾指數(shù)是依據(jù)機體體重來計算的，是直接反映胸腺、脾免疫功能的重要指標［15］，二者的高低變化反映了機體體內(nèi)免疫功能的狀態(tài)。

本實驗結(jié)果顯示RR 組大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均低于正常安靜對照組C 組，表明RBP4 誘導的胰島素抵抗大鼠體重胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)明顯降低。而RE 組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均高于RR 組，則說明耐力運動能顯著提高模型大鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)，提高機體體液、細胞免疫功能，增強防病抗病能力。

總之，RBP4 誘導的胰島素抵抗大鼠免疫功能有所下降，具體表現(xiàn)為:與對照組(C)相比，RBP4 誘導組的HOMA-IR、胸腺的凋亡細胞、血清IL-2、IL-2R 的表達及血清GM-CSF 分別發(fā)生改變;運動干預后，RBP4 誘導的胰島素抵抗大鼠下降的免疫功能部分恢復，具體表現(xiàn)為:與對照組(RR)相比，RBP4誘導組的HOMA-IR、胸腺的凋亡細胞、血清IL-2、IL-2R 的表達及血清GM-CSF 分別發(fā)生改變。

3.6 研究缺陷和進一步研究的方向 本試驗只采用了游泳這種單一的練習方式，沒有設(shè)置專門的力量練習組。而有文獻認為，適當?shù)牧α炕蚩棺枇Ψ桨冈O(shè)計對不適合進行走、慢跑、有氧健身操等練習的2 型糖尿病患者是可行而且有效的［16］。

缺乏胸腺細胞凋亡的定量研究，RBP4 與血清GM-CSF、IL-2 等之間的關(guān)系沒有進一步探討，也是以后研究的方向。

運動能夠明顯提升RBP4 誘導的胰島素抵抗大鼠胸腺細胞抗凋亡能力和免疫能力。該研究在探討胰島素抵抗患者免疫功能紊亂的發(fā)生機制和臨床治療方面有所啟示。

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