程琴 金剛 李慧敏 彭欣怡 黎萍 王麗萍

（廣西亞熱帶作物研究所，南寧 530001）

木薯FEC誘導(dǎo)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展

程琴 金剛 李慧敏 彭欣怡 黎萍 王麗萍

（廣西亞熱帶作物研究所，南寧 530001）

在木薯生物技術(shù)中，轉(zhuǎn)基因植株的生產(chǎn)很普遍，它主要通過(guò)器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑，木薯遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵技術(shù)是FEC的誘導(dǎo)和形成，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的FEC轉(zhuǎn)化在轉(zhuǎn)基因木薯領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。概述木薯再生途徑中體胚和FEC制備、誘導(dǎo)及增值，并對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化及其在木薯中的應(yīng)用等進(jìn)行綜述。

木薯 FEC 農(nóng)桿菌 遺傳轉(zhuǎn)化

木薯在熱帶和亞熱帶的非洲和拉丁美洲是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在亞熱帶地區(qū)作為生產(chǎn)淀粉和生物乙醇的原料［1］。它是營(yíng)養(yǎng)體繁殖的作物，通過(guò)傳統(tǒng)雜交培育新品種非常困難，一方面主要體現(xiàn)在遺傳上高度雜合（heterozygositv）、基因冗余（genetic overloading）、有性子代嚴(yán)重分離等復(fù)雜的遺傳背景；另一方面木薯存在開(kāi)花數(shù)目少、花粉育性低、自交不親和、坐果率低等問(wèn)題［2］，因此開(kāi)展基因工程改良現(xiàn)有品種的品質(zhì)和提高產(chǎn)量已成為當(dāng)前木薯生物技術(shù)研究的重要方向。木薯離體植株再生系統(tǒng)的建立是實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的首要條件，特別是針對(duì)非洲和南美洲的一些品種，目前主要通過(guò)以脆性胚性愈傷組織進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生及子葉胚進(jìn)行芽器官發(fā)生為植株主要再生途徑［3-8］。與其他作物相比，木薯是報(bào)道較晚的可進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的重要作物。經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，基于體細(xì)胞胚胎發(fā)生、胚狀體子葉芽器官發(fā)生及脆性胚性愈傷循環(huán)體系的趨于成熟［1］，為木薯遺傳轉(zhuǎn)化提供了必要的條件（圖1）［9］。轉(zhuǎn)基因植株的獲得很普遍，常用且有成功先例的木薯基因轉(zhuǎn)化方法主要是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法［10］，成熟體細(xì)胞胚的綠色子葉和脆性胚性愈傷組織（FES）是農(nóng)桿菌和基因槍轉(zhuǎn)化的靶組織［11］。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的FEC轉(zhuǎn)化在轉(zhuǎn)基因木薯領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，包括把木薯作為主要經(jīng)濟(jì)作物的發(fā)展中國(guó)家，很多實(shí)驗(yàn)室都在使用這種技術(shù)［12］。本文主要綜述木薯再生途徑中FEC的誘導(dǎo)過(guò)程和各個(gè)階段所需要的培養(yǎng)基，以及FEC形成后用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化的相應(yīng)方法。這在國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道，本文是在前人的研究基礎(chǔ)上，對(duì)木薯再生系統(tǒng)中FEC途徑進(jìn)行更詳盡的概述，為后人研究轉(zhuǎn)基因木薯提供捷徑。

1 體胚和FEC的制備

FEC可以從熱帶木薯系列（TMS）60444葉外植體，莖或側(cè)芽的分生組織里通過(guò)初級(jí)體細(xì)胞胚胎發(fā)生而形成［13］。以組培苗莖段側(cè)芽或頂芽為外植體，在添加Picloram和2，4-D的體細(xì)胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2周后，可誘導(dǎo)胚狀體的形成［6］，使用側(cè)芽分生組織在CAM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)是最好的，因?yàn)樗a(chǎn)生胚胎簇，減少非胚性脆性愈傷組織的累積，（圖2和表1）。初級(jí)胚在CIM培養(yǎng)基累積和純化［14］，連續(xù)繼代培養(yǎng)在GD培養(yǎng)基［15］上的胚性愈傷能產(chǎn)生一種主要由細(xì)小的球形胚組成的結(jié)構(gòu)，即所謂脆性胚性愈傷（FEC）。以GD培養(yǎng)基代替MS培養(yǎng)基可提高胚性愈傷的產(chǎn)量，獲得純的脆性愈傷，再進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，在SH培養(yǎng)基中進(jìn)行迅速擴(kuò)增［6］。生長(zhǎng)素濃度中，2，4-D在6 mg/L及Picloram在12 mg/L為最佳使用濃度，并且Picloram的效果明顯優(yōu)于2，4-D［16］。

表1 木薯組織培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基［13］

2 FEC的誘導(dǎo)、增值及轉(zhuǎn)化

在木薯胚胎發(fā)生基質(zhì)中從未成熟幼葉和頂端或腋分生組織誘導(dǎo)初級(jí)體胚（圖1），通過(guò)接種在相同介質(zhì)中可循環(huán)誘導(dǎo)次級(jí)體胚發(fā)生，繼續(xù)將次級(jí)胚接種在含有12 mg/L 毒莠定的GD培養(yǎng)基中可以產(chǎn)生FEC、次級(jí)胚和非胚性愈傷組織（圖1），一般來(lái)說(shuō)，F(xiàn)EC需要被選擇，長(zhǎng)期在GD固體培養(yǎng)基上作再次培養(yǎng)，為了快速增值，用含有10-12 mg/L毒莠定的

SH懸浮液建立胚胎發(fā)生。胚胎懸浮液在含有1 mg/L萘乙酸的MSN固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，體胚再次形成，然后發(fā)展成子葉胚，最后萌發(fā)成小苗［6，12，13］。因FEC和胚胎懸浮液易被農(nóng)桿菌感染，也有利于基因槍法，外源基因的導(dǎo)入容易。木薯轉(zhuǎn)化常用的是基因槍轉(zhuǎn)化法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，到目前為止，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化木薯已經(jīng)被證實(shí)比基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化更成功［17］。

3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化

將農(nóng)桿菌LBA4404（帶有1305.1載體）放在YEBA+K50/R50/S100上28℃黑暗培養(yǎng)2 d；再放到Y(jié)EB+K50/R50/S100上，以200 r/min 28℃黑暗震蕩培養(yǎng)2 d；將FEC和含有載體的農(nóng)桿菌24℃，16 h光照培養(yǎng)4 d，見(jiàn)圖2。而在轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記選擇方面，目前常用到的有卡那霉素、遺傳霉素、巴龍霉素（nptII gene）、潮霉素（hpt gene）、草銨膦（bar gene）、甘露糖（磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因）等［18］。載體含有GUSPlus 報(bào)告基因，便于顯示轉(zhuǎn)化的成功率。首先FEC在液體培養(yǎng)基SH中培養(yǎng)，之后與農(nóng)桿菌懸浮共培養(yǎng)，利用載體中的抗生素篩選非胚性愈傷（NEFC）［19，20］，得到FEC需要較長(zhǎng)的時(shí)間，一般需要在高含量生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)6個(gè)月，而長(zhǎng)時(shí)間暴露在這樣的培養(yǎng)基上會(huì)導(dǎo)致體細(xì)胞無(wú)性系發(fā)生變異，從而導(dǎo)致木薯株型發(fā)生變異［18］。然而常規(guī)方法獲得FEC再生率很低，促使我們修改接種程序并找到一種新方法：用農(nóng)桿菌懸浮液直接侵染GD培養(yǎng)基上的FEC群簇，見(jiàn)圖2。將FEC和農(nóng)桿菌在培養(yǎng)基上共培養(yǎng)4 d，使用塑料網(wǎng)轉(zhuǎn)移FEC與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)物到新的培養(yǎng)基。這樣減少對(duì)FEC的脅迫，控制營(yíng)養(yǎng)、激素和抗生素平衡。為了使被轉(zhuǎn)化的FEC成熟，共培養(yǎng)后逐漸增加抗生素濃度進(jìn)行篩選，每個(gè)詳細(xì)的步驟使這種技術(shù)在其他實(shí)驗(yàn)室的實(shí)現(xiàn)成為可能，包括把木薯作為主要經(jīng)濟(jì)作物的發(fā)展中國(guó)家［12］。

圖2 FEC和體胚的形成及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌［12］

4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在木薯中的應(yīng)用

與其他的轉(zhuǎn)化方法比較，高效、重復(fù)性好、設(shè)備簡(jiǎn)單和穩(wěn)定表達(dá)是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法的突出優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的基因轉(zhuǎn)化方法［10］。González等［21］用農(nóng)桿菌菌株AB1成功轉(zhuǎn)化西非品種TMS60444的FEC，兩個(gè)株系對(duì)巴龍霉素抗性的轉(zhuǎn)基因特性通過(guò)GUS分析和Southern分析。Zhang等［8］在正負(fù)選擇因子存在下，用農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化TMS60444的胚胎懸浮液，獲得了12種正常轉(zhuǎn)基因株系形態(tài)，5種是用甘露醇篩選的，另外7種具有潮霉素抗性，PCR和Southern分析證實(shí)轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整合到基因組上，RT-PCR和Northern分析證明轉(zhuǎn)基因在再生植株中表達(dá)。Schreuder等［22］為木薯胚胎懸浮液和農(nóng)桿菌侵染建立了一個(gè)高效、可再生的轉(zhuǎn)化程序，在31株GUS活性株系中，14株顯示100% GUS活性，剩下17株顯示72% GUS活性。Southern分析顯示這些植株的轉(zhuǎn)基因特性。Zhang等［23］經(jīng)過(guò)5年研究TMS60444FEC的轉(zhuǎn)化后，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的FEC的轉(zhuǎn)化成功運(yùn)用在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)用這套系統(tǒng)；Zhang和Beltran等通過(guò)木薯胚胎懸浮液，成功引進(jìn)編碼必需氨基酸的合成人工存儲(chǔ)蛋白1（ASP1）基因，通過(guò)Western分析在轉(zhuǎn)基因植株的葉和根中能檢測(cè)到ASP1四聚物，隨后，木薯轉(zhuǎn)化得到了驗(yàn)證，如特定組織啟動(dòng)子［24，25］，抵抗非洲木薯花葉病毒（ACMV）［26-29］，增加蛋白質(zhì)含量［30］，改善木薯褐條病毒抗性［31］。從FEC的誘導(dǎo)到轉(zhuǎn)基因植株再生的整個(gè)過(guò)程［12，13］已經(jīng)被優(yōu)化，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)最突出優(yōu)勢(shì)是可以得到大量的轉(zhuǎn)基因植物，因此，它在木薯基因工程中是最廣泛使用的方法。

5 結(jié)語(yǔ)

木薯TMS60444最佳的轉(zhuǎn)化程序［12］在ETH Zurich（瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院）建立了一套高通量轉(zhuǎn)化平臺(tái)，并將這種技術(shù)傳給非洲實(shí)驗(yàn)室［32，33］。為了適應(yīng)和部署轉(zhuǎn)基因木薯線路改進(jìn)特征，基因依賴轉(zhuǎn)化程序的發(fā)展已經(jīng)被木薯研究社群認(rèn)為是一個(gè)重要步驟［1，32，34］，因?yàn)樗慕研院透咝裕倪M(jìn)的轉(zhuǎn)化方案能滿足木薯在其他農(nóng)民首選品種和地方品種的轉(zhuǎn)基因改良，能維持農(nóng)桿菌-FEC介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的每個(gè)關(guān)鍵步驟的高效性。此方案不僅適用于木薯60444，也能用于農(nóng)民首選地方品種的轉(zhuǎn)基因，這對(duì)以木薯作為糧食和能源作物的地區(qū)非常有利。

總之，經(jīng)過(guò)15年的努力，從1996年第一個(gè)轉(zhuǎn)基因木薯被報(bào)道以來(lái)，木薯遺傳轉(zhuǎn)化已取得顯著進(jìn)展。這項(xiàng)技術(shù)不僅在幾個(gè)先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步發(fā)展，在發(fā)展中國(guó)家的實(shí)驗(yàn)室也運(yùn)用起來(lái)，包括中國(guó)和非洲［32］。除了木薯模式品種用于轉(zhuǎn)基因的改良，農(nóng)民首選品種和地方品種也嘗試用于轉(zhuǎn)基因改良，最近在南非和肯尼亞的實(shí)踐已經(jīng)證明，此方法適合當(dāng)?shù)毓I(yè)首選木薯的轉(zhuǎn)基因改良［33］?；蚋牧家言黾幽臼韺?duì)病毒和非生物脅迫的抗性，減少氰化物毒性，提高了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，以及改善淀粉產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，木薯轉(zhuǎn)基因技術(shù)在是木薯產(chǎn)業(yè)化和食品安全從發(fā)展到實(shí)際應(yīng)用的過(guò)渡。相信在不久的將來(lái)，隨著木薯轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)也將呈現(xiàn)一個(gè)嶄新的舞臺(tái)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Advances in Induction of Cassava FEC and Agrobacterium-mediated Transformation

Cheng Qin Jin Gang Li Huimin Peng Xinyi Li Ping Wang Liping
（Guangxi Subtropical Crops Research Institute，Nanning 530001）

Production of transgenic plants is gradually becoming routine in cassava biotechnology. It is primarily through organogenesis and somatic embryogenesis, the key technology of cassava genetic transformation is friable embryogenic calli（FEC）induction and formation, Agrobacterium-mediated transformation of FEC is the most widely used method to generate transgenic cassava plants.This article provides an overview of cassava regeneration way including embryo and FEC preparation, induction and appreciation, the Agrobacterium-mediated transformation and its application in cassava were summarized.

Cassava FEC Agrobacterium Transformation

2013-10-09

程琴，女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：植物組培及轉(zhuǎn)基因分子育種；E-mail：chengqin413@163.com